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一、目的: 局麻药系临床麻醉最为常用的药物,其所致中枢神经系统(CNS)毒性惊厥为临床上常见的并发症,但目前对局麻药惊厥的发生机制尚无满意的解释。本实验研究的目的是运用膜片钳技术(patch clamp technique,PCT)的细胞贴附模式(Cell-attached)记录方法,从单通道水平研究不同浓度利多卡因对成年大鼠海马CA1区锥体细胞上L-型Ca2+通道活动的影响,以探讨局麻药毒性惊厥的中枢分子机理,进而为临床预防和救治局麻药中毒惊厥提供实验依据。 二、方法: (一)采用酶加机械分离的方法,急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞。 大鼠麻醉后迅速断头取脑,置入用纯O2饱和的低温(0℃~4℃)低钙缓冲液中,用振动切片机切成400 μm厚的冠状脑片,将脑片置于孵育液中,通95%O2-5%CO2混合气体孵育1~6h。取出脑片于低钙缓冲液中分离出海马CA1区,切成1mm2的小片,置于1~1.5g/L的链霉蛋白酶液中酶解30~45min。酶解后的脑片用低钙缓冲液清洗三遍,移入装有2ml低钙缓冲液的试管中,用三根尖端经火抛光的Pasteur吸管梯度吹打使细胞游离。吹打好的细胞悬液静置3min,吸取中层滴加于盖玻片上,粘附10一15min。倒掉未粘附上的组织碎片和细胞,将盖玻片放入加有1一2ml浴槽液的记录浴槽中即可进行离子通道记录。 (二)采用膜片钳技术的细胞贴附记录模式进行离子通道记录。 记录采用细胞贴附(Cell一attached)记录模式,微电极用电极拉制器拉制,入水电阻为6一9M0,封接电阻大于5G0。放大器反馈电阻设置为50GQ,低通滤波频率为l比z,采样频率skHz,间隔55。用去极化脉冲对ea,+通道进行激活,用peLAMP(version 5.0,Axon Instnnnents)clalllpex程序进行数据采集,用Fetchan和 pSTAT对离子通道进行分析。 首先鉴定和观察海马神经元上L一型ca“+通道的基本电生理学和药理学特性。利多卡因经微量加样器依次加入浴槽液中,浓度逐次累加形成6个终浓度(0、2、4、8、16、32林g/ml),记录不同浓度下利多卡因对L一型C扩十单通道活动的影响,资料存入硬盘以备分析和进行统计处理。 二、结果: (一)分离出的成年大鼠海马CA,区锥体细胞形态学特征保存完好,符合实验条件的细胞游离、呈锥形、活性好、贴壁好,整个细胞胞膜清晰、胞休透亮、胞浆均匀一致并保存有较长的轴突、树突,轴突可长达200林m以上。活性细胞还保存了L一型caZ+通道的基本电生理学和药理学特性,易于鉴别。 (二)低浓度利多长因(2、4林g/ml)对L一型caZ+通道的活动无明显影响;浓度达8、16林g/ml时,L一型caZ十通道平均开放时间山对照6.10士o.25ms分别增加到8.12士0.3OmS(P<0.05)、7.71土0.54 ms(P<0.05),浓度达32雌/ml时,开放时间反而降至4.89士0.22 ms(尸<0.05);浓度为8、16、32协g/ml时,整体平均电流分别为0.804士0.092 pA(p<0.05)、0.665士0.073 pA(尸<0.05)、0.370士0.052 pA(p<0,05);当利多卡因达到一定浓度(8、16林g/ml)时,通道开放概率增加(尸<0.05),随着浓度的进一步增加(犯协g/ml),开放概率又逐渐减小(p<0.05)。总体 一4-而言,随着浓度的增加利多卡因对L一型Ca2+通道的影响表现为先兴奋后抑制的作用。 四、结论: (一)成功地建立了一种简单、快速、一可靠的适用于膜片钳单通道记录的成年大鼠海马CA、区锥体细胞的急性分离方法。分离出的海马锥体细胞不仅形态学特征保存完好,并且运用PCT的细胞贴附模式鉴定并记录了L一型caZ十通道的单通道电活动情况,观察了NifediPine和BayK 8644对通道电活动的影响,其结果与相关文献报道的基本一致, (二)利多卡因对成年大鼠海马cA,区锥体细胞L一型ca2+单通道活动的影响呈浓度依赖性的特点:较低浓度时(2、4雌/ml)无明显影响;当增加到一定浓度时(8、16林g/ml),表现出显著的兴奋性作用;当浓度进一步增加到32林留ml时,则表现为明显的抑制作用。实验结果表明高浓度利多卡因引起的cNs功能变化与L一型c扩+通道功能活动的变化有关。提示L一型c扩十通道功能活动的变化可能与局麻药的中枢神经毒性机制有关。