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一、目的： 局麻药系临床麻醉最为常用的药物，其所致中枢神经系统（CNS）毒性惊厥为临床上常见的并发症，但目前对局麻药惊厥的发生机制尚无满意的解释。本实验研究的目的是运用膜片钳技术（patch clamp technique，PCT）的细胞贴附模式（Cell-attached）记录方法，从单通道水平研究不同浓度利多卡因对成年大鼠海马CA1区锥体细胞上L-型Ca2+通道活动的影响，以探讨局麻药毒性惊厥的中枢分子机理，进而为临床预防和救治局麻药中毒惊厥提供实验依据。 二、方法： （一）采用酶加机械分离的方法，急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞。 大鼠麻醉后迅速断头取脑，置入用纯O2饱和的低温（0℃～4℃）低钙缓冲液中，用振动切片机切成400 μm厚的冠状脑片，将脑片置于孵育液中，通95％O2-5％CO2混合气体孵育1～6h。取出脑片于低钙缓冲液中分离出海马CA1区，切成1mm2的小片，置于1～1.5g/L的链霉蛋白酶液中酶解30～45min。酶解后的脑片用低钙缓冲液清洗三遍，移入装有2ml低钙缓冲液的试管中，用三根尖端经火抛光的Pasteur吸管梯度吹打使细胞游离。吹打好的细胞悬液静置3min，吸取中层滴加于盖玻片上，粘附10一15min。倒掉未粘附上的组织碎片和细胞，将盖玻片放入加有1一2ml浴槽液的记录浴槽中即可进行离子通道记录。 （二）采用膜片钳技术的细胞贴附记录模式进行离子通道记录。 记录采用细胞贴附（Cell一attached）记录模式，微电极用电极拉制器拉制，入水电阻为6一9M0，封接电阻大于5G0。放大器反馈电阻设置为50GQ，低通滤波频率为l比z，采样频率skHz，间隔55。用去极化脉冲对ea，+通道进行激活，用peLAMP（version 5.0，Axon Instnnnents）clalllpex程序进行数据采集，用Fetchan和 pSTAT对离子通道进行分析。 首先鉴定和观察海马神经元上L一型ca“+通道的基本电生理学和药理学特性。利多卡因经微量加样器依次加入浴槽液中，浓度逐次累加形成6个终浓度（0、2、4、8、16、32林g/ml），记录不同浓度下利多卡因对L一型C扩十单通道活动的影响，资料存入硬盘以备分析和进行统计处理。 二、结果: （一）分离出的成年大鼠海马CA，区锥体细胞形态学特征保存完好，符合实验条件的细胞游离、呈锥形、活性好、贴壁好，整个细胞胞膜清晰、胞休透亮、胞浆均匀一致并保存有较长的轴突、树突，轴突可长达200林m以上。活性细胞还保存了L一型caZ+通道的基本电生理学和药理学特性，易于鉴别。 （二）低浓度利多长因（2、4林g/ml）对L一型caZ+通道的活动无明显影响;浓度达8、16林g/ml时，L一型caZ十通道平均开放时间山对照6.10士o.25ms分别增加到8.12士0.3OmS（P<0.05）、7.71土0.54 ms（P<0.05），浓度达32雌/ml时，开放时间反而降至4.89士0.22 ms（尸<0.05）;浓度为8、16、32协g/ml时，整体平均电流分别为0.804士0.092 pA（p<0.05）、0.665士0.073 pA（尸<0.05）、0.370士0.052 pA（p<0，05）;当利多卡因达到一定浓度（8、16林g/ml）时，通道开放概率增加（尸<0.05），随着浓度的进一步增加（犯协g/ml），开放概率又逐渐减小（p<0.05）。总体 一4-而言，随着浓度的增加利多卡因对L一型Ca2+通道的影响表现为先兴奋后抑制的作用。 四、结论: （一）成功地建立了一种简单、快速、一可靠的适用于膜片钳单通道记录的成年大鼠海马CA、区锥体细胞的急性分离方法。分离出的海马锥体细胞不仅形态学特征保存完好，并且运用PCT的细胞贴附模式鉴定并记录了L一型caZ十通道的单通道电活动情况，观察了NifediPine和BayK 8644对通道电活动的影响，其结果与相关文献报道的基本一致， （二）利多卡因对成年大鼠海马cA，区锥体细胞L一型ca2+单通道活动的影响呈浓度依赖性的特点:较低浓度时（2、4雌/ml）无明显影响;当增加到一定浓度时（8、16林g/ml），表现出显著的兴奋性作用;当浓度进一步增加到32林留ml时，则表现为明显的抑制作用。实验结果表明高浓度利多卡因引起的cNs功能变化与L一型c扩+通道功能活动的变化有关。提示L一型c扩十通道功能活动的变化可能与局麻药的中枢神经毒性机制有关。