【摘 要】
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研究背景异位骨化（HO,Heterotopic ossification,HO）定义为在肌肉、软组织等骨骼外组织中形成骨组织。近40%的异位骨化患者伴有局部疼痛、运动功能严重受限。目前对于异位骨化形成的机制并未完全阐明。主流观点认为异位骨化病灶形成需要有三个必要的条件:1.可诱导的前体细胞;2.适宜诱导的软组织环境;3.诱导骨化的信号通路。当前临床上针对异位骨化的治疗方式主要有放射及服用非甾体抗炎
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研究背景异位骨化（HO,Heterotopic ossification,HO）定义为在肌肉、软组织等骨骼外组织中形成骨组织。近40%的异位骨化患者伴有局部疼痛、运动功能严重受限。目前对于异位骨化形成的机制并未完全阐明。主流观点认为异位骨化病灶形成需要有三个必要的条件:1.可诱导的前体细胞;2.适宜诱导的软组织环境;3.诱导骨化的信号通路。当前临床上针对异位骨化的治疗方式主要有放射及服用非甾体抗炎药,但他们都具有诸如影响骨愈合、胃肠反应等副作用,急切需要新的治疗方法。研究表明,在成骨分化过程中,需要成骨前体细胞处于低浓度的内源性类维甲酸环境。因此外界人为提高类维甲酸浓度可能具有治疗异位骨化的作用。研究目的围绕异位骨化形成的三要素,分别确定肌腱干细胞（Tendo Stem Cells,TSCs）的异位骨化祖细胞身份,探究炎症微环境（immune microenvironment,IM）在异位骨化中起到的作用。研究核因子k B（nuclear factor-kappa B,NF-κB）以及Smad信号通路与异位骨化的关系,探索帕拉罗汀（Palovarotene）治疗异位骨化的机制。研究方法在体外,我们构建了构建肌腱干细胞和炎症细胞的共培养模型,在体内我们构建了异位骨化SD大鼠模型。通过Western Blot及RT-q PCR,组织切片,免疫组化、免疫荧光以及Mirco CT等实验技术在体内外探究异位骨生成情况,异位骨的源性以及异位骨化发生时成骨相关蛋白、炎症相关蛋白的表达情况。重点关注目标信号通路的激活情况,同时在以上过程中观察帕拉罗汀对异位骨化的阻断作用。接下来,分别构建Smad信号通路以及NF-κB信号通路的过表达与敲减载体,来进一步探寻NF-κB和Smad信号通路在肌腱干细胞成骨分化过程中发挥的协同作用,并探究帕拉罗汀发挥治疗异位骨化作用的机制。研究结果1.在大鼠跟腱组织中定位到了肌腱干细胞,从大鼠跟腱处提取的细胞鉴定为肌腱干细胞。2.在炎症微环境及创伤刺激下,茜素红染色（ARS）及碱性磷酸酶染色（ALP）显示肌腱干细胞钙沉积及碱性磷酸酶含量增加,免疫荧光双染实验显示肌腱干细胞向成骨细胞分化。Micro CT显示建模组大鼠异位骨增加;Western Blot、RT-q PCR、免疫荧光及免疫组化提示在炎症微环境及创伤刺激下肌腱干细胞和HO模型大鼠中成骨基因OCN、RUNX2、SOX9水平上调,炎症因子TNF-α、TGF-β、IFN-γ等水平上调,NF-κB信号通路核心分子P65及Smad信号通路核心分子Smad5水平上调。以上过程均可被帕拉罗汀阻断。3.构建的过表达及敲减载体转染实验显示进一步过表达NF-κB和Smad信号通路成骨分化趋势进一步增强,该趋势可被帕拉罗汀抑制。敲减NF-κB和Smad信号通路可以抑制肌腱干细胞的成骨分化,且成骨分化趋势与给药帕拉罗汀组相似。结论1.肌腱干细胞是异位骨化的前体细胞之一。2.炎症微环境通过激活NF-κB与Smad信号通路在异位骨化病程中扮演重要角色。3.帕拉罗汀可通过去激活NF-κB与Smad信号通路发挥治疗异位骨化的效用。图22表2参105
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