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禽类骨骼不仅是生命活动的基础,而且还与其生产性能密切相关。产蛋期间蛋鸡髓质骨充当机体钙源,为蛋壳形成提供钙,但随产蛋周龄增加,髓质骨钙沉积不足,皮质骨充当机体钙源,造成骨强度下降,骨脆性增加,蛋鸡生产性能下降。本研究旨在筛选与产蛋后期蛋鸡胫骨强度相关基因及遗传标记,为蛋鸡骨代谢、骨质量调控及选育相关研究提供理论基础。选择20只79周龄海兰灰蛋鸡,采集胫骨组织,左侧胫骨用于测定断裂强度,右侧胫骨液氮速冻后用于高通量测序。利用质构仪测定断裂强度,根据测量结果分为高骨断裂强度组（HBS,High bone breaking strength）和低骨断裂强度组（LBS,Low bone breaking strength）,选取体重相近且胫骨强度存在差异的6个个体,定义为H组（H1/H2/H3,3只）和L组（L1/L2/L3,3只）,提取RNA后构建cDNA文库和转录组测序,测序数据进行生物信息学分析。H组和L组得到的总reads数分别为50,955,168和50,772,867,分别有84.58%和85.59%序列有效地比对到鸡参考基因组。在两组间筛选出9个差异表达基因（FDR<0.01）,其中5个基因表达上调（OSCAR,PAX5B,和3个LincRNA）和4个基因表达下调（TIMP4,KLHL14,MPP7和1个未知基因）。GO富集分析结果表明差异表达基因富集在生物学过程（金属酶活性的负调节、Notch信号通路和蛋白质泛素化等）、细胞组成（蛋白质性细胞外基质、细胞外间隙和细胞核等）和分子功能（金属内肽酶抑制剂活性、蛋白酶结合和泛素-蛋白质连接酶活性等）。ASprofile预测得到64,941个可变剪接事件。GATK软件识别得到1,093,870个SNPs。采集20只太行鸡（40和57周龄）和18只海兰灰蛋鸡（79周龄）胫骨,提取RNA和cDNA反转录,选取7个内参基因（B2M、LBR、HPRT1、HMBS、RPL32、18S、RPL5）进行RT-qPCR引物筛选,扩增效率均在95%以上;利用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种不同算法进行稳定性筛选,综合分析结果表明B2M和LBR为推荐稳定内参基因。采集18只海兰灰蛋鸡（79周龄）胫骨,提取RNA和cDNA反转录,利用RT-qPCR技术检测KLHL14、TIMP4、OPN和ON基因mRNA表达,结果显示,KLHL14和TIMP4基因表达水平在H组高于L组（P<0.05）,OPN基因表达水平在HBS组低于LBS组（P<0.05）,ON基因表达水平两组间无显著差异（P>0.05）。利用ELISA检测血清中TIMP4和KLHL14蛋白水平,分析结果发现这两个蛋白水平与骨断裂强度无显著相关（P>0.05）。对PCR产物进行直接测序,与Ensembl数据库比对分析发现,在ON基因发现6个SNPs位点,分别为13632066G>A,13631903A>T,13631874C>T,13631916A>G,13631974A>C,13631916A>G,13631974A>C,13632074A>G,但均与骨强度无显著相关（P>0.05）。综上所述,高通量测序结果发现9个与产蛋后期胫骨断裂强度相关的差异表达基因,其中TIMP4和KLHL14 mRNA表达水平在产蛋后期蛋鸡不同断裂强度的胫骨中存在显著差异。蛋鸡胫骨中稳定表达的内参基因为B2M和LBR。OPN基因mRNA表达水平在产蛋后期蛋鸡HBS组表达低于LBS组。