目的1.采用形态与分子鉴定方法对在中山市不同生境采集的库蠓进行鉴定。2.调查中山市不同生境蠓类的构成、分布及季节消长等情况,为防控蠓及蠓传疾病提供科学依据。3.研究中山市蠓密度与主要气象因素之间的关系,提高蠓密度的监测精度。4.了解中山市蚊类和蠓类所携带的虫媒病毒现状,为中山市虫媒病的预防和控制提供科学依据。方法1.2018年4月上旬至2019年8月上旬用紫外灯诱虫法在7种不同的生态环境中进行蠓类监测,每月的上下旬各监测1次,每个采样点挂诱虫灯3盏,于日落前1 h接通电源,连续灯诱3 h后取出集蠓袋,带回实验室进行种类鉴定。2.用不破坏蠓虫形态的方法提取蠓类基因组DNA,PCR扩增COI基因和Cytb基因的部分序列并测序分析,使用DNAMAN V6和MEGA 6.0软件构建N-J树。将蠓虫体压片,在生物显微镜下形态鉴定。3.使用SPSS20.0和Excel 2007对不同生境的蠓类构成、分布、季节消长进行分析。以2018年8月上旬至2019年8月上旬的25组7个气象因素作为自变量,以同期蠓密度为因变量,分析蠓密度与上述气象因素的相关关系及密切程度。分别采用逐步回归和岭回归方法,建立蠓密度与其相关气象因素的回归模型,并进行模型精度验证。4.2019年6～10月在中山市8个生境采集蚊类和蠓类标本。对采集的标本在冰浴条件下进行形态鉴定,按照采集环境和种类等信息(蚊虫每50只为一个样本,蠓虫400～600只为一个样本)编号记录。样本在实验室研磨、离心,离心后取样本研磨上清液接种BHK-21细胞后将120批蚊、蠓样本研磨液接种BHK-21细胞后,收集出现病变的细胞并进一步通过RT-PCR方法检测病毒基因;此外,使用3个属级病毒特异性基因和6个种级病毒特异性基因引物通过RT-PCR方法对120批样本研磨液进行检测,若电泳结果出现可疑性条带,则将扩增产物送至测序公司进行测序,使用DNAMAN V6和MAGA 6.0软件对测序结果进行序列分析。结果1.库蠓种类形态和分子鉴定的研究结果:共采集到104只库蠓,鉴定结果为原野库蠓Culicoides homotomus、苏岛库蠓C.sumatrae、异域库蠓C.peregrinus、琉球库蠓C.actoni、残肢库蠓C.imicola、连斑库蠓C.jacobsoni、抚须库蠓C.palpifer、荒川库蠓C.arakawai、环斑库蠓C.circumscriptus、尖喙库蠓C.oxystoma、霍飞库蠓C.huffi、似同库蠓C.similis 12种。在构建的COI和Cytb NJ树中,12个种均能各自聚为一支,且支持率均达99%,与形态鉴定结果一致。在构建的2个基因NJ树中,虽然不同蠓属聚在同一大支,但不同蠓的种间无交叉,且相同蠓种的不同个体均聚在同一分支下,支持率达到99%以上,说明COI和Cytb基因适于蠓种级的鉴定。2.蠓类监测结果分析:共捕获蠓类昆虫9428只,经过鉴定共隶属于6属25种,在7个生境中,城郊农庄(一鱼六味饭店有鸡舍)优势种为荒川库蠓,占41.82%,市内公园(紫马岭公园)优势种为落羽铗蠓Forcipomyia pennielongata,占35.40%,其余生境优势种均为丛林铗蠓Forcipomyia bessa,城郊农庄(一鱼六味饭店有家禽舍)吸血蠓数量最多。荒川库蠓、台湾蠛蠓Lasiohelea taiwana是中山市优势吸血蠓,其数量分别占捕获总数的8.62%、1.23%。全年各月份均有蠓活动,2018年8月至2019年8月全年共有3个密度高峰,分别出现在2018年8月上旬至10月上旬、2019年8月上旬。蠓密度和半月平均温度、半月平均气压、半月平均云量之间具有较为明显的相关性,相关系数分别达0.661、-0.593、-0.387。用逐步回归模型和岭回归模型得出预测值,将其用每月下旬实测值进行验证,该两种模型的决定系数分别为0.606、0.635,各项精度指标总结可知,相对逐步回归模型而言,岭回归模型能较好地预测蠓密度。3.中山市蚊、蠓类携带病毒的调查结果:2019年6～10月在中山市共采集到2962只5属6种吸血蚊,22586只2属7种吸血蠓。吸血蚊为白纹伊蚊Aedes albopictus、致倦库蚊Culex quinquefasciatus、三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus、骚扰阿蚊Armigeres subalbatus、常型曼蚊Mansonia uniformis、中华按蚊Anopheles sinensis,其中数量最多为白纹伊蚊,占总数量的75.22%。吸血蠓为荒川库蠓、琉球库蠓、尖喙库蠓、霍飞库蠓、抚须库蠓、环斑库蠓、台湾蠛蠓。其中数量最多为荒川库蠓,占总数量的98.93%。蚊、蠓虫标本总共研磨120批,将120批蚊、蠓样本研磨液接种BHK-21细胞后,收集出现病变的细胞并进一步通过RT-PCR方法检测病毒基因,检测结果均阴性;此外,使用3个属级病毒特异性基因和6个种级病毒特异性基因引物通过RT-PCR方法对120批样本研磨液进行检测,出现了2条可疑性条带但测序结果为白纹伊蚊基因组并非病毒序列。通过RT-PCR方法对120批蚊、蠓样本可能携带3个属级病毒特异性基因引物(黄病毒属、甲病毒属、布尼亚病毒属)和6个种级病毒特异性基因引物(版纳病毒、西藏环状病毒、盖塔病毒、寨卡病毒、登革病毒、日本乙型脑炎病毒)的检测结果均阴性。结论1.雄性库蠓可根据其尾器进行有效鉴定,雌性库蠓难以根据形态进行有效鉴定,分子鉴定为形态鉴定的有效补充。联合形态和分子的鉴定方法可进行蠓种级的准确鉴定。2.通过本次调查,建议中山市蠓类主要防治对象为荒川库蠓和台湾蠛蠓。在7个生境中,城郊农庄(有家禽舍)吸血蠓数最多,是重点防控的区域。半月平均温度、半月平均气压和半月平均云量是影响蠓密度的主要影响因子。依据建立的2种预测回归模型中,岭回归模型的预测值与实测值之间的误差较小,岭回归模型能够较好地反映主要气象因子对蠓密度的活动情况。3.本研究将120批蚊、蠓样本研磨液接种BHK-21细胞后,收集出现病变的细胞并进一步通过RT-PCR方法检测病毒基因,检测结果均阴性;此外,使用特异性病毒基因引物通过RT-PCR方法对120批样本研磨液进行检测,出现了可疑性条带并测序分析为白纹伊蚊基因组,进一步确认检测结果均阴性。有必要进行更加大量且广泛的采集工作以了解中山市蚊、蠓虫媒病毒的携带情况。