目的:为掌握羊源伪结核棒状杆菌的分离鉴定,了解其致病性,探求其制备的灭活疫苗的免疫效果,以期为进一步研究该病原的致病机制及其防控奠定基础。方法:(1)病原分离鉴定:将贵州某羊场疑似发病山羊的病料接种于普通琼脂平板、鲜血营养琼脂和LB液体培养基中观察其培养基生长形态基特征;根据疑似细菌的16Sr RNA序列设计引物,挑选单个菌落进行PCR扩增,连接p MD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,然后测序获取伪结核棒状杆菌的16Sr RNA序列;再通过序列的同源性比对,将分得菌株进行鉴定命名。将该菌株皮下注射和腹腔注射小鼠,观察小鼠发病和死亡情况。(2)命名菌株灭活疫苗免疫效果初探:将命名菌株的OD600稀释在0.06-0.09之间,包被酶标板。4℃包被过夜后用脱脂奶粉封闭,加入稀释的待检血清,37℃孵育1 h,加入酶标二抗,37℃孵育1h,加入TMB显色,随后用稀H2SO4终止反应,建立检测命名菌株的间接ELISA方法。将命名菌株摇菌过夜后,用甲醛灭活,加入ISA206VG佐剂制备灭活疫苗。取10只Balb/c小鼠,分别在0d和14d进行免疫接种,二免后14d皮下接种菌液进行攻毒。同时设非免疫攻毒组对照和健康对照组。攻毒后观察小鼠发病或感染情况。结果:(1)分得菌株命名为羊源伪结核棒状杆菌GZ2015。成功获了取该菌株的16Sr RNA序列,并克隆至p MD18-T载体中,序列长度为1504 bp。腹腔注射小鼠6 h后小鼠陆续发病,24 h内小鼠全部死亡。皮下注射小鼠12 h后注射部位皮下出现脓肿,2 d后脓肿部位破裂,有黄白色牙膏状脓汁流出。(2)羊源伪结核棒状杆菌GZ2015灭活疫苗免疫效果初探:将伪结核棒状杆菌GZ2015的菌体包被酶标板过夜后,优化的待检血清稀释度为1:400,酶标二抗最佳稀释度为1:5000,建立间接ELISA方法。检测免疫后的小鼠血清,血清抗体水平持续升高。攻毒组小鼠发病率达80%(8/10),而免疫小鼠的发病率仅为20%(2/10)。结论:(1)伪结核棒状杆菌GZ2015腹腔注射能致小鼠100%死亡,皮下注射能产生脓肿,该细菌对小鼠的致病力较强。(2)建立了检测伪结核棒状杆菌抗体的间接ELISA方法,该方法可用于疫苗免疫后及感染该病原的血清抗体检测。(3)制备的伪结核棒状杆菌GZ2015灭活疫苗可诱导机体产生较好的免疫保护。