原发性肝癌是临床常见恶性肿瘤,在全球实体瘤发病率中排名第六,致死率排名第三。2020年全球肝癌新发病例约91万,肝癌死亡病例约83万。中国是原发性肝癌高发国家,全球每年新发和死亡的病例约有一半在中国。肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是原发性肝癌最常见的病理类型,所占比例约为85%-90%。目前临床上应用最广泛的HCC早期筛查和辅助诊断的指标是甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）。AFP主要由胎儿肝细胞产生,出生后肝脏AFP基因快速关闭失活,因此成年血清中AFP含量极少。约70-80%的HCC患者能检测到血清AFP的异常增高。因此,当锌指蛋白ZBTB20（Zinc finger and BTB domain contain 20）被发现是AFP的关键转录抑制因子时,其在肝癌发生发展中的作用引起了广泛的兴趣。转录因子ZBTB20是含有BTB/POZ结构域的新型锌指蛋白,本实验室长期致力于ZBTB20功能的研究,并发现其在多个生理过程中,如发育、内分泌、代谢、认知、疼痛、昼夜节律的维持和免疫应答等,发挥重要的功能。实验室既往研究表明,ZBTB20是AFP强有力的转录抑制因子,在小鼠肝脏的发育过程中,Zbtb20基因被渐进激活,与Afp基因的表达水平呈负相关。肝脏Zbtb20特异性敲除小鼠出生后肝脏Afp水平异常升高,一直维持近乎胎儿期表达水平。鉴于AFP异常激活表达与HCC的密切关系,ZBTB20作为AFP的特异转录抑制因子是否与HCC的发生发展有关?王红阳院士课题组首先发现ZBTB20在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且ZBTB20的表达量与肝癌患者的预后呈负相关。He等分析乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）阳性肝癌患者组织中HBV DNA整合入肝癌细胞基因组的情况,发现ZBTB20属于HBV DNA高整合基因,而且ZBTB20在HCC组织中的表达量与HBV整合频率呈正相关,提示HBV感染可能是导致ZBTB20在HCC中表达增高的原因。Jeffrey等发现在Trp53基因敲除的背景下过表达ZBTB20可导致小鼠肝脏肿瘤结节数量明显多于单独Trp53基因敲除组。这些研究均提示ZBTB20可能促进肝癌的发生发展。我们实验室前期通过sh RNA的方法构建稳定干扰ZBTB20的肝癌细胞株,并利用该细胞株进行裸鼠荷瘤实验,发现干扰ZBTB20后不论是皮下还是肝脏原位荷瘤的生长都受到明显抑制。这些研究均有力的提示ZBTB20对HCC的发展具有促进作用。那么ZBTB20在HCC的发生发展中究竟起什么样的作用?以及这种作用的可能机制是什么?为此,我们进行了以下三部分的研究。1、ZBTB20促进肝癌进展我们首先构建了ZBTB20过表达慢病毒载体,分别感染人肝癌Huh7和PLC/PRF/5细胞,构建ZBTB20稳定过表达的肝癌细胞株,并利用实验室已有的ZBTB20稳定干扰的人肝癌Huh7细胞株,通过CCK8增殖实验证实过表达或干扰ZBTB20不改变常规（2D）细胞培养条件下肝癌细胞的增殖。考虑到传统2D细胞培养时营养物质和氧气的供给都是充足的,与体内肿瘤细胞所处的低氧、低糖、高乳酸的肿瘤微环境相差甚远。因此,我们进一步利用3D细胞培养技术模拟体内肝癌细胞的生长,结果发现过表达ZBTB20肝癌Huh7细胞球体积增大的速率明显高于对照组;反之,干扰ZBTB20则显著抑制肝癌Huh7细胞球体积增大的速率。软琼脂克隆形成实验证实过表达ZBTB20肝癌Huh7细胞克隆数显著多于对照组;反之干扰ZBTB20则克隆数显著少于对照组。在肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型中,过表达ZBTB20促进Huh7细胞皮下移植瘤的生长。以上结果证实ZBTB20可以促进肝癌进展。2、ZBTB20上调HIF-α促进肝癌血管生成低氧诱导因子（hypoxia-induced factor,HIF）是肿瘤发生发展过程中适应肿瘤微环境（如氧气和营养物质缺乏等）的关键调节因子,其能调控肿瘤的血管生成、能量代谢改变、干性介导的肿瘤细胞的自我更新、以及细胞增殖、凋亡等。HIF由氧敏感的HIF-α亚基（含HIF-1α、HIF-2α与HIF-3α）与组成性表达的HIF-β亚基构成异源二聚体发挥其转录因子的功能,HIF活性调节主要依靠调节HIF-α亚基的蛋白稳定性来实现。我们在肿瘤数据库TCGA（The cancer genome atlas）中利用GSEA富集分析了371例临床肝癌病例,结果发现ZBTB20表达增高与HIF1和HIF2信号通路的激活显著相关。因此我们检测了ZBTB20对HIF-1/2α蛋白表达的影响,结果发现ZBTB20过表达的肝癌细胞皮下移植瘤中HIF1/2α的蛋白表达明显高于对照组;常氧下,过表达ZBTB20则上调肝癌细胞中HIF-1/2α蛋白水平,干扰ZBTB20表达则下调肝癌细胞中HIF-1/2α蛋白水平;此外,ZBTB20还能增加常氧下HEK293A细胞中外源性HIF1/2α的蛋白表达。我们进一步检测了ZBTB20对HIF靶基因表达的影响,结果发现在肝癌Huh7细胞中,干扰内源性ZBTB20的表达明显下调了HIF靶基因的转录,其中包含血管生成相关靶基因AGR2、EPO,糖酵解相关靶基因HK1、SLC2A1、SLC16A3和肿瘤干性相关靶基因PROM1、CD24等;而过表达ZBTB20则上调肝癌细胞中血管生成靶基因AGR2、EPO的转录;ZBTB20过表达的肝癌细胞皮下移植瘤中HIF的靶基因m RNA水平也明显增高。以上结果提示ZBTB20可上调HIF-1/2α蛋白,促进HIF的转录激活作用。HCC是一种血供极为丰富的恶性肿瘤。肿瘤生长早期依靠周围组织弥散的营养物质来维持其生长,当肿瘤生长至直径1-2 mm时,就需要形成新生血管提供自身营养。HIF在肿瘤新生血管的生成中具有关键的调控作用,其靶基因血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是最重要的促血管生成因子,VEGF通过与内皮细胞膜上的血管内皮生长因子受体（Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR）结合,引起受体自身的磷酸化,激活细胞内信号通路,促进内皮细胞增殖和迁移,促进新生血管生成。前梯度蛋白2（Anterior gradient 2,AGR2）是一种分泌蛋白,属于蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）家族。AGR2受HIF的转录调节。在肿瘤间隙液中AGR2有高浓度的累积,胞外的AGR2能够增加VEGF和VEGFR结合的稳定性,增强VEGF/VEGFR信号激活,进而促进肿瘤新生血管的生成。我们利用CD31免疫荧光标记肝癌细胞皮下移植瘤组织中的血管内皮细胞,发现ZBTB20过表达组的平均微血管密度（Microvessel density,MVD）明显高于对照组。过表达ZBTB20的肝癌Huh7细胞条件培养基促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）管腔形成;干扰HIF-1β（抑制HIF转录活性）或AGR2均能阻断ZBTB20对HUVEC管腔形成的促进作用。进一步用免疫组化的方法检测临床HCC患者样本中ZBTB20和HIF-1α的表达和定位,CD31免疫荧光标记血管内皮细胞,结果发现ZBTB20在肝癌组织中的表达明显高于正常肝组织,且超过90%的病例（59/62）ZBTB20异位表达在肝癌细胞胞浆,胞浆ZBTB20的表达量与HIF-1α表达和MVD均呈正相关。以上结果表明ZBTB20能通过上调HIF-α蛋白,激活血管生成相关基因,促进肝癌血管生成。3、ZBTB20上调HIF-α蛋白的分子机制HIF-α由4个功能结构域组成,分别是b HLH（basic Helix-Loop-Helix）结构域、PAS（Per-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-Sim）结构域、ODD（oxygen-dependent degradation domain）结构域和TAD（transactivation domains）结构域（含N-TAD和C-TAD）。其中ODD结构域是调节HIF-α氧依赖性降解的关键结构域,又被称为HIF-α稳定性调节结构域,大部分的转录后修饰都发生在该结构域中。常氧条件下,脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase,PHD）激活使得HIF-1/2α的ODD结构域中402/405位和564/531位脯氨酸发生羟基化,羟基化的HIF-1/2α被von Hippel-Lindau（VHL）等E3泛素连接酶复合体识别并结合,发生泛素化修饰后经蛋白酶体通路降解。因此,常氧下HIF-α蛋白在细胞内维持着极低的水平。缺氧条件下,PHD的活性受抑制,HIF-α不能发生羟基化,导致VHL识别并降解HIF-α的通路受阻,因此HIF-α蛋白在胞浆累积,累积的HIF-α入核与HIF-1β形成二聚体发挥转录因子功能。HIF-1α与HIF-2α结构高度同源,降解通路基本一致,因此本部分以HIF-1α为主探讨ZBTB20上调HIF-α蛋白的分子机制。我们利用实时荧光定量PCR检测发现过表达或干扰ZBTB20不改变HIF-1/2α的m RNA水平。利用放线菌酮（cycloheximide,CHX）抑制新生蛋白的合成,检测分析ZBTB20对HIF-1α蛋白稳定性的影响,结果发现干扰ZBTB20后肝癌Huh7细胞中HIF-1α蛋白降解速率加快,半衰期显著缩短,表明ZBTB20可以增加HIF-1α蛋白的稳定性。利用蛋白酶体抑制剂MG132阻断肝癌细胞和HEK293A细胞中蛋白酶体降解通路,发现ZBTB20过表达或干扰对HIF-1/2α蛋白水平的上调或下调的趋势明显减弱,但不能完全消除,提示ZBTB20除了可以通过抑制蛋白酶体降解通路增加HIF-1/2α蛋白的稳定性外,还存在其他调控途径（比如蛋白翻译）。然后利用免疫共沉淀（Co IP）实验分析了ZBTB20与HIF-1α的相互作用。GST pulldown实验证实原核表达的GST-ZBTB20融合蛋白可与体外翻译的HIF-1α直接结合;进一步分别截短ZBTB20和HIF-1α,发现ZBTB20通过其锌指结构域与HIF-1α的ODD结构域内N-TAD直接结合,该结构域包含可发生羟基化的564位脯氨酸。常氧下,ZBTB20并不减少HIF-1α亚基402位和564位脯氨酸的羟基化水平;ZBTB20仍然可以上调HIF-1α-P2A突变体（402位和564位脯氨酸突变为丙氨酸,不能发生羟基化）的蛋白水平。Co IP结果显示,无论HIF-1α是否发生上述脯氨酸位点的羟基化,均能与ZBTB20相互作用;而ZBTB20过表达可抑制HIF-1α与VHL的结合。ZBTB20不影响HIF-1α总泛素化和K63多聚泛素化修饰水平,但抑制了介导HIF-1α蛋白酶体降解的K48多聚泛素化修饰。综上所述,ZBTB20在常氧下能通过其锌指结构域与HIF-α的N-TAD结构域直接结合,进而抑制VHL对HIF-α的识别和结合,减少介导HIF-α蛋白酶体降解的K48多聚泛素化修饰,抑制其蛋白酶体通路的降解,从而稳定HIF-α蛋白,增强HIF对血管生成相关靶基因的转录激活作用,促进HCC血管生成和肿瘤进展。本课题首次揭示了ZBTB20转录调控以外的新功能,通过调节HIF-α蛋白稳定性促进HCC进展,为HCC治疗药物的研发提供新的靶点和思路。