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成年脑神经元再生是脑结构和功能可塑性以及脑损伤修复的重要事件，众多研究显示此事件涉及到NMDA受体激活。NMDA受体在中枢神经系统具有广泛且极为重要的生理功能。随着研究的不断深入，我们发现NMDA受体的复杂性远远超出了先前的想象。NMDA受体依赖NR2亚单位不同亚型表达不同的受体功能，表现出不同的电生理学和药理学特性。各亚基在不同区域的表达有所不同，在成年海马分布的调节亚单位主要是NR2A和NR2B。NR2A和NR2B亚基不仅对配体的选择性和敏感性不同，而且介导的细胞内信号迥异。一直以来，NMDA受体对成年神经元再生的调控是有争议的。那么，NR2A和NR2B对神经元再生的作用又会是怎样的呢?nNOS是NMDA受体下游的信号酶，并且nNOS是神经元再生的负性调控因子。所以，NMDA受体可能通过nNOS来调节神经元再生。我们认为可能存在如下假说：NR2A的胞内羧基端通过PSD-95与nNOS偶联，当含NR2A的NMDA受体激活时，抑制nNOS，从而促进神经元再生。而NR2B亚基的胞内羧基端通过PSD-95与nNOS偶联，当含NR2B的NMDA受体激活时，激活nNOS，从而抑制神经元再生。因此，NR2A和NR2B逆向调控神经元再生：NR2A激活促进神经元再生而NR2B激活抑制神经元再生。本文将对NR2A和NR2B在生理状态下对神经元再生的作用及其机制作深入研究，此外，本文还将利用Morris水迷宫这一评价动物学习记忆尤其是空间记忆功能较为客观而准确的方法，直接对动物的行为学进行测定，对NR2A／NR2B对海马依赖性的学习记忆的影响及其分子机制作进一步探讨。上述观点如得到验证，可进一步阐明成年脑神经元再生的分子机制，并深入认识NMDA受体对脑结构和功能的可塑性的重要性；同时，对脑卒中、脑创伤、神经退行性疾病等的治疗药物研究也具有重要意义。第一章：NR2A和NR2B逆向调控神经元再生目的：通过药理学方法抑制含NR2A和NR2B的NMDA受体，观察生理状态下NR2A和NR2B被抑制后对体外培养的神经干细胞（NSCs，neural stem cells）增殖的作用和对成年小鼠侧脑室下区（subventricular zone，SVZ）及海马齿状回（dentate gyrus，DG）神经元再生的影响。利用nNOS-／-小鼠进一步探讨NR2A／NR2B调控神经元再生的分子机制，阐明nNOS在此机制中所起的作用。方法：采用选择性NR2A抑制剂NVP-AAM077（10mg／kg，腹腔注射，连续给药2次，给药间隔为24小时）及选择性NR2B抑制剂Ro25-6981（5mg／kg，腹腔注射，连续给药2次，给药间隔为24小时）分别抑制NR2A和NR2B，然后腹腔注射BrdU（50mg／kg，连续给药6次，给药间隔为12小时）标记新生细胞，观察生理状态下抑制NR2A和NR2B后对SVZ区和海马DG区细胞的增殖及DG区存活的影响。为了考察nNOS在上述NR2A和NR2B的神经元再生调控中所起的作用，我们分别给nNOS-／-小鼠腹腔注射NVP-AAM077（10mg／kg，腹腔注射，连续给药2次，给药间隔为24小时），Ro25-6981（5mg／kg，腹腔注射，连续给药2次，给药间隔为24小时）后，BrdU标记新生细胞，观察各组小鼠SVZ区和海马DG区新生细胞的增殖，溶剂对照组等容积给予生理盐水作为对照。同时采用nNOS+／+小鼠作为背景鼠进行平行对照。结果：NR2A选择性抑制剂NVP-AAM077显著抑制NSCs的细胞数（P<0．05），显著抑制了SVZ和海马DG区细胞的增殖（P<0．05），抑制DG区新生细胞的存活（P<0．05），而NR2B选择性抑制剂Ro25-6981显著增加了NSCs的细胞数（P<0．05），显著增加了SVZ和海马DG区细胞的增殖（P<0．05），增加DG区新生细胞的存活（P<0．05）。与溶剂对照组相比，NVP-AAM077组nNOS+／+小鼠SVZ区和DG区的BrdU阳性细胞数显著减少(SVZ：F2，15=37．76，P=0．048；DG：F2，15=31．11，P=0．047)，而Ro25-6981组nNOS+／+小鼠其SVZ区和DG区的BrdU阳性细胞数显著增加(SVZ：F2，15=37．76，P<0．001；DG：F2，15=31．11，P<0．001)。对于nNOS-／-小鼠，无论是NVP-AAM077组还是Ro25-6981组的SVZ区和DG区的BrdU阳性细胞数与溶剂对照组相比均无显著差异(SVZ：F2，15=0．31，P=0．74；DG：F2，15=1．89，P=0．186)。结论：NR2A和NR2B逆向调控神经元再生，即NR2A上调而NR2B下调神经元再生，并且这种作用是nNOS依赖性的。第二章：NR2A／NR2B影响海马依赖性学习记忆目的：通过药理学方法抑制含NR2A和NR2B的NMDA受体，考察NR2A和NR2B与海马依赖性学习记忆能力的关系。方法：采用Morris水迷宫，对腹腔注射NR2A选择性拮抗剂NVP-AAM077和NR2B受体选择性拮抗剂Ro25-6981的小鼠分别进行学习记忆等行为观察，检测空间学习和记忆能力，与溶剂对照组相比，考察NR2A和NR2B对海马依赖性空间学习记忆的作用。结果：（1）在隐蔽平台实验中：与溶剂对照组小鼠相比，药后29-34天NVP-AAM077组小鼠的逃避潜伏期明显高于对照组（P<0．05），而Ro25-6981组小鼠的逃避潜伏期则明显低于对照组，而在给药后1-6天进行的同样实验中，两组小鼠的逃避潜伏期与对照组相比未见明显差异，两组动物的游泳速度与对照组相比也无明显差异；（2）在空间探索实验中：给药后35天NVP-AAM077组小鼠在靶象限（原平台所在象限）的停留时间明显低于溶剂对照组（P<0．05），Ro25-6981组小鼠在靶象限的停留时间明显高于对照组（P<0．05），NVP-AAM077组小鼠的穿台次数明显少于溶剂对照组小鼠（P<0．05），Ro25-6981组小鼠的穿台次数明显多于对照组小鼠（P<0．05）；观察两组小鼠的撤台轨迹，NVP-AAM077组小鼠寻找平台的方式是围绕迷宫周边进行而Ro25-6981组小鼠的则多在原平台附近寻找。而在给药后7天进行的实验中，NVP-AAM077组、Ro25-6981组小鼠与对照组小鼠相比，无论是在靶象限停留时间还是穿台次数均无明显差别。（3）在可视平台实验中，无论是NVP-AAM077组还是Ro25-6981组小鼠的平均逃避潜伏期与溶剂对照组相比均无明显差异（P>0．05）。同时，两组小鼠的游泳速度、体重、摄食量以及在旷场实验中的水平与垂直运动次数与对照组均无显著性差异（P>0．05）。结论：选择性地抑制NR2A受体对海马依赖性学习记忆能力有损害作用，而选择性地抑制NR2B受体对学习记忆能力有增强作用。含NR2A和NR2B的NMDA受体逆向调节海马依赖性学习记忆。第三章：NR2B对海马依赖性学习记忆的作用依赖于神经元再生目的：通过给予动物端粒酶抑制剂脱氧叠氮胸苷（3′-azido-2′，3′-dideoxythymidine，AZT），观察其对体外培养的神经干细胞（NSCs）扩增和成年小鼠SVZ和海马齿状回（dentate gyrus，DG）神经元再生的影响，并且利用其作为工具，抑制Ro25-6981的促进神经元再生作用，探讨NR2B对海马依赖性学习记忆的作用与神经元再生的相关性。方法：给予体外培养的NSCs 100和200μMAZT，考察其对NSCs扩增的作用；给予AZT（50、100、200mg／kg，腹腔注射，连续给药14次，给药间隔为24小时），末次给药2小时后给予BrdU（50mg／kg，连续给药6次，给药间隔为12小时）标记新生细胞。最后1次BrdU注射6小时后处死动物，观察生理状态下AZT是否影响SVZ区和海马DG区细胞增殖；之后，我们运用AZT阻断海马神经祖细胞增殖，来研究海马神经元再生与海马依赖性学习记忆间的相互关系：我们将小鼠分为4组，即溶剂对照（Vehicle）组、AZT+Ro25-6981组、Ro25-6981组和AZT组。其中AZT+Ro25-6981组先给小鼠腹腔注射AZT（100mg／kg，给药14次，间隔24小时），在AZT给药的第10-11天，给予Ro25-6981（5mg／kg，给药2次，间隔24小时），AZT给药的第12-14天注射BrdU（50mg／kg，连续给药6次，给药间隔为12小时）；Ro25-6981组小鼠先等容积腹腔注射生理盐水9天（每日1次），第10-11天，给予Ro25-6981（5mg／kg，给药2次，间隔24小时），第12-14天注射BrdU（50mg／kg，连续给药6次，给药间隔为12小时）；AZT组小鼠腹腔注射AZT（100mg／kg，给药14次，间隔24小时），在AZT给药的第12-14天注射BrdU（50mg／kg，连续给药6次，给药间隔为12小时）；Vehicle组小鼠等容积腹腔注射生理盐水14天（每日1次），在第12-14天注射BrdU（50mg／kg，连续给药6次，给药间隔为12小时）。BrdU末次给药结束后6小时，各组处死部分动物进行BrdU免疫组化。各组其余动物分别在药后第1-6天和29-34天进行Morris水迷宫的隐蔽平台实验，在药后第7和35天进行空间探索实验，以观察各组动物海马依赖性空间学习记忆能力，最后，进行BrdU计数，观察各组海马细胞增殖情况，并且考核其和平均逃避潜伏期之间有无相关性。同时另取小鼠同法分组给药，在药后1-4天和29-32天进行可视平台实验，以考察各组对非海马依赖性学习记忆的影响。结果：大鼠胚胎神经干细胞给予AZT72h后，100和200μM AZT均可显著抑制其增殖（P<0．05）。BrdU阳性细胞计数结果表明，生理状态下给予AZT后，100 mg／kg和200mg／kg组小鼠SVZ区和海马DG的新生细胞数与溶剂对照组相比均有显著减少（P<0．05），且200 mg／kg组动物的体重明显降低（P<0．05）。故我们认为100 mg／kg AZT是抑制神经元再生的合适剂量。在研究海马神经元再生与海马依赖性学习记忆的相互关系的实验中，我们发现：AZT+Ro25-6981组小鼠的BrdU阳性细胞数明显少于单用Ro25-6981的小鼠(F3，16=17．34，P=0．003)，与溶剂对照组相近(F3，16=17．34，P=0．890)，表明Ro25-6981的促进神经元再生的作用可以被AZT所取消。同时，Ro25-6981促进海马依赖性学习的作用也被AZT所逆转，并且DG区细胞的存活数和平均逃避潜伏期之间有很好的相关性。结论：NR2B对海马依赖性学习记忆的作用依赖于神经元再生。NR2A和NR2B双向调节海马依赖性学习记忆的作用是由其逆向调控神经元再生而产生的。