论文部分内容阅读
目的分离纯化眼镜蛇毒神经生长因子(nerve growth factor, NGF)及具有NGF活性的物质,并对其理化性质和生物活性进行研究。方法(1)采用凝胶过滤层析和离子交换层析法分离眼镜蛇粗毒,得到NGF和具有NGF活性的组分Ⅱ(我们将其命名为NGFx),通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)测定它们的分子量并鉴定纯度。(2)采用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞培养法,测定NGF和NGFx的生物活性,分别在倒置相差显微镜和电子显微镜下观察突起的生长情况。(3)采用血清药理学的方法,将分离纯化的NGF对大鼠进行灌胃,制成NGF含药血清,然后通过MTT法测定该含药血清在体外的抗肿瘤活性。(4)采用毛细管电泳对NGFx的纯度做进一步鉴定,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定其分子量,并通过基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱鉴定其是何种物质。结果(1)通过凝胶过滤和离子交换方法,分离得到NGF和具有NGF活性的NGFx,经过SDS-PAGE,计算出NGF的分子量为24 547, NGFx的分子量为19588,均已达到电泳纯。(2)NGF和NGFx分别作用PC12细胞后,与细胞对照组相比,在倒置相差显微镜和电镜下均见到细胞体长出突起,但是较之NGFx作用组,NGF作用后长出的突起更长,更密集。在电镜下除看到突起外,还可见胞质中的细胞器逐渐消失,出现较多的脂滴。(3)不同浓度的NGF含药血清对体外生长的肿瘤细胞的抑制率不同,NGF含药血清浓度为25.00%、12.50%、6.25%对人胃癌MGC-803细胞的抑制率分别为86.95%、30.38%、10.32%,对人胃癌SGC-7901细胞的抑制率分别为78.50%、56.78%、47.20%,对人肝癌BEL-7404细胞的抑制率分别为46.36%、41.17%、34.53%,对人宫颈癌Hela细胞的抑制率分别为77.31%、70.19%、37.48%,与对照组相比均P<0.05。(4)将NGFx进一步通过毛细管电泳柱,只见一个峰；基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定其分子量为19892.818,经过MALDI-TOF/TOF串联飞行时间质谱鉴定后,将所得肽序列与NCBI数据库中的序列比对,得到的匹配分值仅为62,分值较低,无法判断其是何种物质。结论(1)分离得到的NGF和NGFx均能诱导PC12细胞向神经样细胞分化,长出突触。NGFx虽然能促进PC12细胞分化,但是其活性,是否新物质以及何种物质还需进一步确定。(2)广西眼镜蛇毒NGF含药血清对人胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901、人肝癌细胞株BEL-7404和人宫颈癌Hela细胞均有生长抑制作用,且呈剂量依赖性。