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布鲁菌病是由布鲁菌引起的一种人兽共患传染病,患病动物主要表现为生殖器官炎症、流产、不孕及各种组织的局部病灶,给我国畜牧业造成巨大经济损失。人类也可以通过食用被感染动物的畜产品或直接接触被感染动物而感染布鲁菌病,对人类的生命健康造成极大威胁,然而,现有布鲁菌病疫苗具有保护力不够、毒力返强、无法与自然感染动物区分等诸多问题,在布鲁菌致病机制研究方面,国内外还都处在比较基础的阶段,极大地制约了布鲁菌病的防控和研究。因此,布鲁菌病的防控及机制研究就显得极其必要和迫切。布鲁菌基因缺失菌株在研究布鲁菌致病机制和疫苗创制等方面具有重要的作用,但是目前常用的同源重组方法制备布鲁菌基因缺失菌株还存在操作不够简便、耗时长、成功率偏低等问题。CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统是近几年发展起来的一种高效、精确的基因编辑系统,通过一段短的RNA分子(sg RNA)和Cas9核酸内切酶来分别识别和切割靶基因序列,具有较强的特异性、高效性和简便性。而且CRISPR-Cas9介导的基因编辑系统在真核细胞上已经广泛应用并且取得了非常显著的成果,为CRISPR-Cas9系统介导原核生物的基因编辑提供了良好的理论和实践基础。本研究拟构建适用于布鲁菌的CRISPR-Cas9介导的基因编辑载体。为了解决基因缺失布鲁菌株后期的基因补足问题,以及保证CRISPR-Cas9介导的布鲁菌基因编辑载体的正确构建,首先以广宿主克隆载体p BBR1MCS-5-EGFP为骨架载体,构建了能够在布鲁菌内稳定表达外源基因的表达载体,在构建好的表达载体基础上构建了CRISPR-Cas9介导的布鲁菌基因编辑载体。研究结果如下:(1)以能够在布鲁菌内复制的广宿主克隆载体p BBR1MCS-5-EGFP为骨架载体,在其Nsi I和Xba I酶切位点间插入能够在布鲁菌内正常工作的庆大霉素抗性基因的启动子(Gm R promoter),并在启动子下游添加Flag-tag以便于外源基因的检测,构建得到p BBGm R-Flag载体;在p BBGm R-Flag载体的Xba I和Sac I酶切位点间插入设计好的多克隆位点(MCS),以便于外源基因的克隆,构建得到布鲁菌表达载体p BBGm R-Flag-MCS。为验证p BBGm R-Flag-MCS能否在布鲁菌内表达外源基因,将布鲁菌bp26基因克隆到了该载体上,经Western blot验证,布鲁菌表达了Flag-bp26重组蛋白,表明本研究构建的表达载体能够在布鲁菌内稳定表达外源基因。(2)在PX330载体Cas9基因上游添加Sal I位点得到了改造后的PX330~+载体,经Sal I和Eco R I双酶切获得Cas9基因;改造了g RNA scaffold序列并添加了启动其转录的启动子序列,全基因合成后通过分步酶切的方式获得了g RNA scaffold;以p BBGm R-Flag-MCS为骨架载体,在Kas I和Bsp H I酶切位点间插入优化、合成的g RNA scaffold,构建得到了p BBGm R-sg RNA载体;在p BBGm R-sg RNA载体Sal I和Eco R I酶切位点间插入Cas9基因,构建得到了CRISPR-Cas9介导的布鲁菌基因编辑载体p BBGm R-sg RNA-Cas9。本研究构建了能够在布鲁菌内稳定表达外源基因的表达载体p BBGm R-Flag-MCS和CRISPR-Cas9介导的布鲁菌基因编辑载体p BBGm R-sg RNA-Cas9。构建的布鲁菌表达载体简化了布鲁菌基因缺失株的基因补足工作,CRISPR-Cas9介导的布鲁菌基因编辑载体则有望大幅提高布鲁菌基因缺失菌株制备的效率和精确度。