论文部分内容阅读
目的1选择稳定且高表达CCR5及FOXP3的HIV-1易感细胞作为实验研究对象,姜黄素作用细胞后进行转录组测序,分析并筛选差异基因,依据转录组测序结果及KEGG分析结果筛选出姜黄素作用的主要信号通路。2检测姜黄素对HIV-1感染辅助受体CCR5的影响,观察姜黄素作用后人单核细胞THP-1细胞CCR5表达情况以及对PI3K/AKT信号通路的影响。3验证转录因子FOXP3与CCR5启动子之间的结合。探索姜黄素基于PI3K/AKT信号通路调控FOXP3干预HIV-1感染辅助受体CCR5的分子作用机制。方法本研究采用实时荧光定量PCR法和Western Blot法分别检测HIV-1易感细胞:Jurkat细胞、H9细胞、THP-1细胞、M0细胞CCR5和FOXP3的表达水平,挑选稳定且高表达CCR5及FOXP3的细胞作为实验研究对象。采用改良MTT法检测不同时间的不同浓度的姜黄素对细胞活性的影响。通过转录组测序技术（RNA-Seq）得到姜黄素作用前后THP-1细胞转录水平的变化,获得姜黄素作用前后差异基因,并对差异基因进行GO和KEGG分析,依据测序结果及KEGG分析结果筛选出姜黄素作用的主要通路。再采用实时荧光定量PCR法和Western Blot法分别检测姜黄素及PI3K/AKT信号通路激活剂（YS-49）作用THP-1细胞后对PI3K/AKT信号通路蛋白及CCR5表达情况的影响,采用实时荧光定量PCR法检测PI3K/AKT信号通路抑制剂（LY294002）作用THP-1细胞后CCR5 mRNA表达情况。最后采用CHIP技术和EMSA技术验证转录因子FOXP3与CCR5基因位点之间的结合。结果1.细胞株1.1实时荧光定量PCR检测预选细胞系CCR5和FOXP3 mRNA表达水平实时荧光定量PCR法检测结果显示:人单核细胞系THP-1细胞具有稳定且高表达的CCR5和FOXP3 mRNA水平,适合作为本实验研究的研究对象。1.2 Western Bloting检测预选细胞系CCR5和FOXP3蛋白表达水平Western Bloting法检测结果显示:人单核细胞系THP-1细胞具有稳定且高表达的CCR5和FOXP3蛋白水平,适合作为本实验研究的研究对象。1.3改良MTT法检测姜黄素对THP-1细胞增殖的影响MTT实验检测结果显示:姜黄素对THP-1细胞活性具有一定抑制作用,姜黄素作用于THP-1细胞24 h,48 h和72 h后IC50分别为40.21μmol/L,24.69μmol/L和23.14μmol/L。2.差异基因筛选及分析转录组测序技术成功筛选出姜黄素作用的主要通路PI3K/AKT信号通路作为研究对象。3.姜黄素对PI3K/AKT通路及CCR5的影响3.1实时荧光定量PCR检测姜黄素作用THP-1细胞CCR5 mRNA表达水平实时荧光定量PCR检测结果显示:姜黄素作用于THP-1细胞后,随着姜黄素浓度升高,CCR5 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）,且呈现出剂量依赖性。YS-49作用THP-1细胞后,CCR5 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）。姜黄素与YS-49共同作用时,姜黄素能够回复YS-49对CCR5 mRNA的升高作用,差异具有显著性（P＜0.01）,表现出姜黄素与YS-49作用相拮抗。3.2 Western Bloting检测姜黄素作用THP-1细胞PI3K/AKT通路蛋白及CCR5蛋白表达水平Western Bloting检测结果显示:姜黄素作用THP-1细胞后,随着姜黄素浓度升高,CCR5蛋白表达均显著降低（P＜0.01）。YS-49组细胞CCR5蛋白表达明显升高（P＜0.05）。Curcumin+YS-49组细胞中CCR5蛋白表达水平较Curcumin 30组明显升高（P＜0.05）,较YS-49组明显降低（P＜0.05）。姜黄素作用THP-1细胞后,随着姜黄素浓度升高,p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT均显著降低（P＜0.01）。对姜黄素作用PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平的综合分析结果表明:姜黄素能够在一定程度上抑制PI3K及AKT蛋白磷酸化。YS-49组细胞p-PI3K/PI3K及pAKT/AKT无差异（P＞0.05）,但p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT水平均显著增高（P＜0.01）;Curcumin+YS-49组细胞中p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平较Curcumin 30组无差异（P＞0.05）,但较YS-49组显著降低（P＜0.01）。3.3实时荧光定量PCR检测PI3K/AKT通路抑制剂（LY294002）作用THP-1细胞CCR5 mRNA表达水平实时荧光定量PCR检测结果显示不同浓度LY294002作用于THP-1细胞后,CCR5 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,且具有剂量依赖性。4.FOXP3与CCR5基因位点的结合4.1 CHIP验证THP-1细胞FOXP3与CCR5基因位点的结合CHIP电泳结果显示:各实验组出现FOXP3阳性条带（47k D）,提示经FOXP3抗体的使用分离出的蛋白为目标FOXP3蛋白。实时荧光定量PCR结果显示:各实验组CCR5启动子序列（223bp）明显高于阴性对照IgG组,提示经过FOXP3抗体的使用所分离出的DNA含有预测的CCR5启动子序列。CHIP实验说明THP-1细胞转录因子FOXP3与CCR5的启动子序列相结合。4.2 EMSA验证姜黄素作用THP-1细胞FOXP3与CCR5基因位点的结合EMSA结果显示:随着姜黄素浓度升高,转录因子FOXP3与CCR5的结合受到抑制,且具有一定的剂量依赖性。PI3K/AKT通路激活剂（YS-49）促进了转录因子FOXP3与CCR5结合位点的结合。姜黄素回复了YS-49对转录因子FOXP3与CCR5结合位点结合的增强作用,表现出与YS-49相拮抗的效果。结论1姜黄素可通过抑制PI3K/AKT信号通路调控转录因子FOXP3的表达抑制CCR5的表达。2转录因子FOXP3能够与CCR5基因启动子位点结合,姜黄素能够抑制转录因子FOXP3与CCR5基因位点的结合。