果实无核是柑橘的优良性状，雄性不育是柑橘无核的主要原因。温州蜜柑雄性不育是线粒体基因与细胞核基因相互作用引起的雄性不育。以温州蜜柑为母本进行有性杂交，创制了许多无核柑橘新品种。但是，柑橘线粒体基因组信息和细胞质雄性不育(CMS)机制还不清楚。前人利用细胞融合技术，将‘国庆1号’温州蜜柑雄性不育细胞质转移给HB柚，获得HB柚胞质杂种，是研究细胞质雄性不育的理想试材。本研究以HB柚胞质杂种及其融合双亲为试材，通过线粒体基因组及全基因组测序，组装和注释了高质量HB柚胞质杂种及其双亲线粒体基因组；从基因组水平确定了HB柚胞质杂种核、质基因组来源；通过不育材料HB柚胞质杂种和‘国庆1号’温州蜜柑与可育材料HB柚线粒体基因组和转录组比较分析，在不育材料中鉴定到57个与线粒体编码基因共转录的CMS特异ORFs，并挑选orf88作为候选基因，对其潜在的调控细胞质雄性不育的机制进行研究。主要研究结果如下：
　　1.‘国庆1号’温州蜜柑和HB柚线粒体基因组基本信息
　　以‘国庆1号’温州蜜柑愈伤组织和HB柚黄化苗为试材，提取线粒体DNA；用‘国庆1号’温州蜜柑愈伤组织和HB柚叶片提取总DNA。分别采用Sanger、Illumina和PacBio三种测序技术，完整组装了‘国庆1号’温州蜜柑和HB柚线粒体基因组；大小分别为521,559bp和518,274bp，GC含量分别为45.06%和45.14%，线粒体编码蛋白数分别为36和35个。‘国庆1号’温州蜜柑和HB柚线粒体基因组有28个重排区域，相似片段总长460,067bp。同时，RNA编辑位点和编辑效率在这两个品种间具有物种特异性。
　　2.HB柚胞质杂种细胞质和核基因组来源
　　HB柚胞质杂种线粒体基因组大小为538,434bp，与‘国庆1号’温州蜜柑线粒体基因组几乎一致，并且存在一个额外的16.8kb同源重组片段；与HB柚线粒体基因组同源的长度为472.3kb(87.7%)。共线性分析结果显示，HB柚胞质杂种线粒体基因组96.9%的序列与‘国庆1号’温州蜜柑具有共线性，剩余3.1%是HB柚胞质杂种线粒体基因组的重复序列。HB柚胞质杂种线粒体基因组与HB柚线粒体基因组有29个重排区域，其中28个重排区域与‘国庆1号’温州蜜柑和HB柚的一致。HB柚胞质杂种、‘国庆1号’温州蜜柑及HB柚叶绿体基因组大小分别为160,423bp、160,159bp、160,590bp，GC含量均为38.47%。HB柚胞质杂种及其亲本叶绿体基因组之间相似性达99%；HB柚胞质杂种与HB柚叶绿体基因组序列有11个SNPs和42个InDels变异位点，与‘国庆1号’温州蜜柑叶绿体基因组序列有384个SNPs和120个InDels变异位点。此外，HB柚胞质杂种及其亲本与甜橙参考基因组SNP和InDel统计结果显示，HB柚胞质杂种及其亲本核基因组与甜橙基因组共有946,383个SNPs和200,661个InDels。其中，HB柚胞质杂种99.8%的SNPs位点和96.9%的InDels位点与HB柚一致。因此，HB柚胞质杂种叶绿体和细胞核基因组应来自HB柚。
　　3.HB柚胞质杂种胞质雄性不育候选基因筛选与功能验证
　　基于不育系HB柚胞质杂种与‘国庆1号’温州蜜柑和可育系HB柚转录组和线粒体基因组比较分析，在HB柚胞质杂种和‘国庆1号’温州蜜柑线粒体基因组中分别鉴定到21条和20条CMS线粒体特异序列，89和70个CMS特异ORFs。从这些特异ORFs中鉴定到和rps13‘端138bp互补序列在同一个嵌合转录本DN16978的3个特异ORFs(orf55、orf59和orf88)。将转录本DN16978构建超量表达载体转入拟南芥，成功获得拟南芥转基因系，并表现出一系列不育表型。跨膜结构域和亚细胞定位预测这三个特异ORFs结果表明orf88编码蛋白含有跨膜结构域，且自身含有线粒体定位信号肽，认为orf88可能是HB柚胞质杂种CMS基因。利用酵母双杂交筛库技术获得orf88互作蛋白CsNADH(NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 12)。酵母双杂点对点实验及LUC荧光检测实验表明orf88与CsNADH基因互作。亚细胞定位显示orf88和CsNADH均定位于线粒体。
　　综上所述，本研究组装了HB柚胞质杂种及其融合双亲的线粒体基因组；发掘了可能与HB柚胞质杂种细胞质雄性不育相关的基因orf88，鉴定了与orf88互作的基因CsNADH，并对orf88调控细胞质雄性不育的内在机制进行了讨论。