聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）广泛应用于食品真实性鉴别检测,其扩增产物通常具有确定的长度,因此测定PCR产物长度能够鉴别PCR反应的特异性以及多重PCR反应的靶标来源。平板凝胶电泳和毛细管凝胶电泳是最常用的PCR产物长度测定方法,但通常需要转移溶液且过程繁琐复杂。熔解分析能够实现PCR产物的快速简便鉴别,但却无法获取长度信息,因为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）的熔解温度（meltingtemperature,Tm）数值不仅取决于长度,还有鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine,GC）含量。为了克服这种局限,本研究通过在PCR产物中加入小分子季铵盐,消除GC 比例对Tm影响的方式,建立了基于熔解温度测定PCR产物长度的方法,并将其应用于乳制品中牛、山羊、绵羊三种动物源性成分的多重PCR检测。具体研究内容和结果如下:（1）PCR产物长度的荧光标记熔解测定方法。由于小分子季铵盐添加剂与荧光染料对DNA存在竞争性结合,优先选用荧光标记的方式,研究通过加入添加剂消除GC含量对Tm值影响的可行性,建立PCR产物长度的熔解测定方法。结果显示,通过优化G碱基的数量改善其对5’端FAM标记荧光的猝灭作用,能够获取DNA在29-522 bp范围内不同长度的Tm值;增加Mg2+浓度至6 mM能够减少DNA浓度改变造成的Tm值波动;添加四甲基氯化铵升高Tm值,而四乙基氯化铵和甜菜碱则降低Tm值,但三种添加剂的加入均可消除GC 比例对Tm值的影响,得到取决于长度（29-236bp）的Tm值,以及GC 比例（35-63%）与Tm改变值（ΔTm）的线性相关方程,以此实现了 PCR产物长度的熔解测定。（2）PCR产物长度的非标记荧光熔解测定方法。为了进一步降低检测成本,优化筛选了 DNA荧光染料种类和浓度,用于替代5’端FAM标记获取各种长度PCR产物的Tm值,建立PCR产物长度的非标记熔解测定方法。结果显示,在 EvaGreen、SYBRGreenⅠ、LC Green、ResoLight 等四种 DNA染料中,浓度为2×的EvaGreen染料对加入三种添加剂存在时的熔解曲线干扰较小,与扩增反应兼容,并且能够获取某些FAM标记DNA时无法测得的Tm;三种添加剂的加入同样可以消除GC比例对Tm值的影响,得到取决于长度（29-522 bp）的Tm值和GC比例与ΔTm值的线性相关方程,实现了 PCR产物长度的染料熔解测定。（3）PCR产物长度熔解测定的牛羊乳区别检测应用。为了验证方法的实际应用能力,建立了基于PCR产物长度差异的多重PCR熔解检测方法,用于乳及乳制品中山羊、奶牛、绵羊动物源性成分的鉴别。结果显示,所设计选取的山羊、奶牛、绵羊特异性PCR扩增产物长度分别为65 bp、100bp、157bp,长度差异明显,但是Tm值均在78.3-79.0℃,熔解曲线相互交叉重叠,无法通过Tm差异实现三种目标的同时检测;而在添加四乙基氯化铵或甜菜碱后,山羊、奶牛、绵羊三种目标的Tm分别降低至55.4℃、57.0℃、59.1℃或67.4℃、68.8℃、70.4℃,Tm差异＞1℃,能够实现三种组分的同时鉴别检测;实际乳品样品的熔解分析结果与毛细管凝胶电泳方法一致,表明该方法可用于乳制品的真实性鉴定。本研究建立的PCR产物长度测定方法,简便快速,无需进行繁琐的电泳实验,仅需常规荧光PCR即可完成,即可用于PCR反应特异性和多重PCR反应的鉴别检测,具有较强的实际应用价值。