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研究背景:肝细胞肝癌(HCC)是死亡率最高的恶性肿瘤之一,因缺乏早期症状或体征,患者就诊时多处于中晚期,错失手术切除根治或肝移植的机会。不可切除肝癌的介入治疗或系统性药物治疗的效果相对不佳,患者预后较差。因此,探索肝癌治疗的新策略对于肝癌患者而言具有十分重大的意义。抗肿瘤纳米药物输送体系的研发是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。通过无机材料或高分子有机材料等纳米材料装载抗肿瘤药物,并进行特定靶向基团的修饰,可显著增加抗肿瘤药物在肿瘤部位的富集,减少毒副作用。对抗肿瘤药物进行前药化修饰,能够改善药物与聚合物载体间的相容性,提升纳米药物在血液循环中的稳定性,进一步增加疗效。此外,传统化疗药物与分子靶向药物的联合用药也是肿瘤治疗的重要策略之一,可起到协同增效、减少肿瘤耐药、降低单药剂量并减少毒副作用的效果。研究目的:本研究通过前药策略制备聚乳酸修饰的阿霉素(DOX)前药或7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)前药,分别探索其与DSPE-PEG和PEG-PLA等材料在水中自组装形成纳米粒的能力。利用HCC靶向性多肽SP94对材料进行修饰,并探索载药纳米粒对HCC的靶向能力。探索化疗药物伊立替康/SN38与酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼在HCC中的抗肿瘤效果,研究药物协同增效的可能机制,并验证载SN38前药纳米粒与达沙替尼联用的效果。研究方法:第一部分:本研究将PLA通过酰胺键共价连接至DOX分子上,形成PLA修饰的DOX前药(PLA-DOX),将HCC靶向多肽SP94通过硫醇-马来酰亚胺偶联反应连接至 DSPE-PEG2000-Mal 上,形成 SP94 修饰的 DSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000-SP94)。利用 PLA-DOX 与 DSPE-PEG2000 或 DSPE-PEG2000-SP94在水中自组装形成非靶向性或HCC靶向性的载阿霉素前药纳米粒(nNP-PLA-DOX与tNP-PLA-DOX),并进行粒径、Zeta电位、电镜观察、药物释放等表征。利用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术检测细胞对药物的内吞作用。利用CCK-8检测nNP-PLA-DOX与tNP-PLA-DOX对不同HCC细胞株的作用,并利用EdU染色验证纳米药物对HCC增殖能力的影响。最终在裸鼠皮下移植瘤模型与活体成像实验中验证不同载药纳米粒的抗肿瘤效果与肿瘤靶向性。第二部分:本研究利用SRB法检测SN38与达沙替尼对不同HCC细胞的作用,并利用克隆形成实验研究不同药物对HCC细胞增殖能力的影响。利用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测SN38与达沙替尼作用下的细胞凋亡情况,利用DAPI染色观察细胞核的形态,并通过WB检测细胞凋亡相关蛋白c-PARP和c-caspase-3等。利用JC-1染料结合流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,并通过WB检测凋亡线粒体途径相关蛋白Bcl-2和Bax等。利用qRT-PCR和WB检测SN38作用后PLK1的mRNA和蛋白水平的变化,并利用PLK1 siRNA和PLK1质粒转染探究PLK1与SN38药效间的关系。利用溶酶体抑制剂氯喹(CQ)、蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂CHX探究两药联用对PLK1抑制的作用机制。最终在裸鼠皮下移植瘤模型中验证伊立替康与达沙替尼两药联用的抗肿瘤效果。第三部分:本研究将PLA通过酯键共价连接至SN38分子上,形成聚乳酸修饰的SN38前药(PLA-SN38)。利用PLA-SN38与PEG5000-PLA8000在水中自组装形成载SN38前药纳米粒(NP-PLA-SN38),并进行粒径、Zeta电位、电镜观察、药物释放等表征。利用CCK-8检测NP-PLA-SN38对不同HCC细胞株的作用。在BEL-7402细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中比较NP-PLA-SN38与伊立替康对HCC的作用,并在HCC的PDX模型在中验证NP-PLA-SN38与达沙替尼两药联用的抗肿瘤效果。研究结果:第一部分:PLA-DOX 与 DSPE-PEG2000 或 DSPE-PEG2000-SP94 可在水中自组装形成非靶向性或靶向性纳米粒(nNP-PLA-DOX与tNP-PLA-DOX),水合粒径分别为 122.6±3.8 nm 与 75.3±9.6 nm,Zeta 电位分别为-14.83±0.61 mV 与-3.10±1.51 mV,并经 TEM 和 SEM 观察摄片。nNP-PLA-DOX 与 tNP-PLA-DOX 在 37℃pH 7.4的条件下有明显缓释特性,在20天的药物释放量分别为30.09±2.53%和32.55±0.48%。共聚焦激光显微镜和流式细胞术检测显示HCC细胞对tNP-PLA-DOX的内吞作用要明显强于nNP-PLA-DOX,而在正常肝细胞或肺癌细胞中无此现象。CCK8检测的结果显示tNP-PLA-DOX在HCC-LM3和BEL-7402细胞中的IC50分别为6.571±0.855 μM和3.729±0.702 μM,显著低于nNP-PLA-DOX 的 9.283±0.422 μM 和 6.921±0.841 μM,但是体外毒性均不如游离DOX。EdU染色提示tNP-PLA-DOX对于HCC细胞的抗增殖能力要强于nNP-PLA-DOX。在HCC-LM3细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中,活体成像与离体成像实验提示tNP-PLA-DOX对肿瘤组织的靶向能力要显著强于nNP-PLA-DOX,体内抗肿瘤药效实验显示NP-PLA-DOX的体内抗肿瘤效果要显著优于游离DOX,且毒性更低,其中,tNP-PLA-DOX 的效果要优于 nNP-PLA-DOX(tNP-PLA-DOX、nNP-PLA-DOX、游离 DOX 的抑瘤率,72.83%vs 57.29%vs 31.70%)。第二部分:SN38与达沙替尼在BEL-7402和HepG-2细胞中的合用指数(CI)均小于0.4,展现出了强协同效果。克隆形成实验证明了两药联用可显著增强SN38或达沙替尼对于细胞增殖的抑制作用。Annexin-V/PI结合流式细胞术检测结果显示达沙替尼可增强SN38的致凋亡作用,DPAI染色也可发现两药联用下典型凋亡细胞的比例增加。WB结果显示两药联用后细胞凋亡相关蛋白c-PARP和c-caspase-3的蛋白水平显著上升,凋亡线粒体途径相关抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平下降而促凋亡蛋白Bax蛋白水平上升。JC-1染色结合流式细胞术检测结果显示两药联用可促进线粒体膜电位水平的下降。SN38作用后细胞PLK1的mRNA和蛋白水平有所下降,两药联用可进一步抑制PLK1,沉默PLK1可导致c-PARP蛋白水平的升高,而过表达PLK1则会减少SN38作用下的c-PARP升高。CQ和MG132预处理无法逆转两药联用所致的PLK1蛋白水平下降,而CHX处理与两药联用所致的PLK1抑制水平在蛋白质层面相仿,提示两药联用通过抑制蛋白质合成抑制PLK1。在HepG-2细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中,伊立替康与达沙替尼两药联用的抗肿瘤效果要显著优伊立替康或达沙替尼两药单用(两药联用、伊立替康单用、达沙替尼单用的抑瘤率,49.67%vs 10.70%vs 14.56%),且无明显毒副作用。第三部分:PLA-SN38与PEGs000-PLA8000可在水中自组装形成纳米粒(NP-PLA-SN38),水合粒径与Zeta电位分别分别为50.9±0.243 nm与-0.015±0.862 mV,并经TEM观察摄片。NP-PLA-SN38在37℃ pH 7.4的条件下有一定的缓释特性,在10天的药物释放量51.22±6.56%。CCK8检测的结果显示NP-PLA-SN38 在 HCC-LM3 和 BEL-7402 细胞中的 IC50 分别为 15.08±2.396 和1.663±0.219 μM,接近游离SN38。在BEL-7402细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中,抗肿瘤药效实验显示NP-PLA-SN38的体内抗肿瘤效果要显著优于游离SN38(NP-PLA-SN38、游离 SN38 的抑瘤率,83.04%vs 50.96%),且毒性更低。在 HCC的裸鼠PDX模型中,还进一步验证了 NP-PLA-DOX与达沙替尼联用的体内抗肿瘤效果(抑瘤率86.86%),要显著优于游离SN38与达沙替尼联用(抑瘤率54.19%)。结论:本研究构建了 一种基于前药策略的HCC靶向性纳米药物输送体系,SP94修饰可明显提升载阿霉素前药纳米粒的HCC靶向能力,增加阿霉素在肿瘤部位的富集,增强抗肿瘤效果并降低毒副作用。此外,本研究还发现伊立替康/SN38与达沙替尼联合用药可通过抑制PLK1的蛋白合成起到协同抗肿瘤效果,利用相同前药策略构建的载SN38前药纳米粒与达沙替尼联合应用可进一步加强抗肿瘤效果。