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前列腺癌（Prostate cancer,PCa）成为世界范围内男性的第二大导致死恶性肿瘤疾病,前列腺癌也在发达国家是最为常见的恶性肿瘤之一,近几年以来前列腺癌在中国大陆的发病率急剧呈上升[1]。前列腺癌疾病具有较高的发病率和死亡率。前列腺癌疾病一旦发生淋巴结或者（和）其他组织器官转移,患者的病情预后不良,患者的总生存期非常短[2]。当今世界中已经拥有了许多成熟的治疗前列腺癌的手段,例如等待观察和主动监测、外科手术切除、放射科放疗、内分泌治疗、化疗等。其中雄激素剥夺治疗（Androgen deprivation therapy,ADT）方法是治疗前列腺癌最有效的方法之一,但是许多患者在治疗过程中会产生耐药性,最后会因生化复发发生疾病进展[3],导致去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer,CRPC）疾病的发生。目前临床上对去势抵抗性前列腺癌的治疗方法主要有两种:一种为化学治疗,另一种为新型内分泌治疗[4]。新型内分泌治疗的主要药物为恩杂鲁胺和阿比特龙。虽然该治疗手段可有效延长患者生存时间,但对治疗出现原发耐药现象的并不罕见:阿比特龙和恩杂鲁胺原发耐药的分别约占所有患者的三分之一和四分之一[5],而对CRPC治疗初始敏感的药物都在24个月内出现继发耐药[6]。接下来本文将分述建立去势抵抗性前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞株的过程、功能学和分子生物学水平验证试验以及针对亲代细胞和耐药细胞的全外显子组测序结果。目的本课题使用C4-2细胞系建立去势抵抗性前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞株（后简称为耐药细胞）模型,并进行全外显子组测序,分析细胞发生的各种突变,筛除已知的相关突变后,得到与耐药相关的突变。通过测量IC50以及检测细胞的生存及生长（MTT）情况,证明耐药细胞成功建立。体外功能实验观察耐药细胞的的增殖、侵袭及迁移能力,分子生物学实验了解耐药相关基因及蛋白的表达情况。通过全外显子组测序,我们得到耐药细胞的三种不同变异的结果,筛选出了可能与耐药相关的突变,为临床治疗去势抵抗性前列腺癌耐药的病人提供新的方法和思路。方法本研究通过复苏天津医科大学第二医院性激素实验室-80℃冻存的去势抵抗性前列腺癌（C4-2）细胞系。经多次换液、传代,得到稳定生长的亲代前列腺癌细胞。选择状态良好,数量相近的细胞做分组处理,实验组给予持续的10微末每升的培养基培养,对照组给予加入相应浓度DMSO培养及培养,期间为细胞换液及传代,观察其生长情况。待实验组细胞生长速度与对照组生长速度相近时,选取部分两组细胞做MTT实验,量化细胞的生存及生长情况。扩增并冻存能稳定遗传的实验组及对照组细胞株。给予剩余的实验组细胞20微末每升的培养基培养,对照组给予加入相应浓度DMSO培养及培养,重复以上操作,至药物升至40微末每升。通过检测实验组与对照组细胞的IC50,证实耐药细胞株的成功建立。体外实验通过克隆形成实验、Transwell实验及划痕实验,分别观察亲代细胞与耐药细胞的增殖能力的差异、侵袭能力的差异以及迁移能力的差异。采用RT-q PCR的方法检测亲代细胞与耐药细胞中相关耐药基因（AR-FL、AR-V7、Malat 1及CYTOR）的表达差异情况。采用Western Blot实验,验证亲代细胞与耐药细胞中与耐药相关的蛋白质（AR-FL、AR-V7）的表达差异情况。全外显子组测序,利用探针杂交捕获技术将基因组外显子区域的DNA序列捕获并富集,然后进行高通量测序的基因组分析。以此得到亲代细胞与耐药细胞的相关突变结果。结果经过浓度梯度以此递增的方法成功诱导出了去势抵抗性前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞株,光镜下,与亲代细胞相比,耐药细胞株胞浆中颗粒物增多,细胞周围的触角明显增多,细胞呈岛状生长特征。通过MTT实验能够看出耐药细胞株在普通培养基和浓度为40微摩尔每升的恩杂鲁胺培养基中均能够稳定增殖,并且增殖速度相似,而亲代细胞在普通培养基中能够稳定增殖,但是在浓度为10微摩尔每升的恩杂鲁胺培养基中增殖受到抑制。测量IC50实验结果显示,亲代细胞和耐药细胞对恩杂鲁胺的药物敏感性具有明显的差异,亲代细胞和耐药细胞对恩杂鲁胺的IC50分别为62.71微摩尔每升和17.10微摩尔每升,耐药细胞的耐药性约为亲代细胞的3.667倍。证实了去势抵抗性前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞株对恩杂鲁胺产生了低度耐药的特性。细胞克隆形成实验证实,耐药细胞增殖能力明显高于亲代细胞。细胞Transwell-Invsion实验证实,耐药细胞侵袭能力增强,明显高于亲代细胞。细胞划痕愈合实验证实,耐药细胞迁移能力明显高于亲代细胞。q PCR结果显示耐药相关基因AR-FL、AR-V7、Malat1、CYTOR的表达含量均明显增高。WB结果显示随着药物刺激浓度的增高,耐药细胞中AR-FL、AR-V7蛋白表达量逐渐增高。结论本试验成功的建立了去势抵抗性前列腺癌的恩杂鲁胺耐药细胞株,并且成功验证了耐药细胞的生物学功能及分子生物学改变。该耐药细胞株可以模拟临床中对恩杂鲁胺产生耐药的CRPC病人的肿瘤特性。全外显子组测序结果,找到了可能与耐药相关的突变,该部分仍需后续验证。