【摘 要】
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降钙素(Calcitonin,CT)在临床上主要用于治疗骨质增生、各种原因引起的骨骼疼痛症状、Paget'S疾病、高钙血症等.现临床应用的主要是从鲑鱼鳃和猪甲状腺分离纯化的降钙素,来源
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降钙素(Calcitonin,CT)在临床上主要用于治疗骨质增生、各种原因引起的骨骼疼痛症状、Paget'S疾病、高钙血症等.现临床应用的主要是从鲑鱼鳃和猪甲状腺分离纯化的降钙素,来源有限,价格昂贵.尽管研究者已在原核细胞表达系统对鲑鱼降钙素的表达进行了研究,但由于原核表达系统缺乏翻译后的加工修饰等缺点,限制了其应用.因此,利用植物表达系统大规模生产降钙素,满足社会对降钙素日益增长的需求,具有重要的实际意义.该研究旨在由鲑鱼降钙素(<,s>CT)基因的链霉菌表达载体构建<,s>CT基因的植物表达载体;并将<,s>CT基因转入生菜等作物,使其成为降钙素的新型生物反应器,为降钙素的生产提供一条经济有效的新途径.主要研究结果如下:1.通过限制性内切酶BamHI/HindⅢ酶切<,s>CT基因的链霉菌表达质粒pMS680获得<,s>CT基因,并将其克隆至植物表达载体pART27,获得sCT基因的植物表达载体pART27-<,s>CT,并通过电击转化法成功转化土壤根癌农杆菌C58.2.通过基因枪微弹射入法将<,s>CT基因导入胡萝卜愈伤组织;酶联免疫法检测<,s>CT蛋白的瞬时表达情况,结果表明<,s>CT基因能够在胡萝卜愈伤组织中表达.3.通过研究不同激素浓度对大速生散叶生菜子叶外植体再生的影响,确定其适宜的诱芽培养基为:MS+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA,生菜子叶外植体的再生率为60.3%;抗生素敏感性试验表明,适宜的Km选择压为75mg/L,Carb的浓度为300mg/L.4.通过农杆菌介导的叶盘法,将<,s>CT基因转入烟草及生菜,经在含75mg/LKm的诱芽培养基和1/2MS生根培养基筛选,获得Km抗性烟草40株,生菜118株;经PCR检测,得到转基因烟草11株,转基因生菜29株.
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