背景:在世界范围内,乳腺癌已经成为女性肿瘤性疾病中发病率居第一位,死亡率位居第二的恶性肿瘤。据2007年统计,全世界每年约有7.9万新发乳腺癌病例,占全部女性恶性肿瘤总数的21%。全世界乳腺癌年均发病率为30.30/10万,世界人口调整率为32.97/10万。其中近60%的乳腺癌新发病例在发达国家。虽然乳腺癌的发病率在世界范围内差异较大,但整体呈上升趋势,发病年龄也呈年轻化。在我国一些大城市,乳腺癌已位居妇女癌症中第一位,成为女性恶性肿瘤的头号杀手。因而提高乳腺癌的疗效和治愈率已成为迫在眉睫的问题。乳腺癌作为一种全身性疾病,以手术、化疗、放疗和内分泌治疗相结合的综合治疗是当前乳腺癌的标准治疗模式。随着全身性疾病观念的确立,全身化疗在综合治疗中所起的作用必不可少。在众多化疗方案中,以阿霉素为代表的葸环类同以多西紫杉醇为代表的紫杉醇类化疗药物扮演着不可或缺的角色,对减少复发和改善预后起着至关重要的作用。BCIRG 001和NSABP B-28临床实验显示含蒽环类和紫杉类的（TAC）方案疗效显著,被推荐为乳腺癌辅助化疗的标准方案。然而,临床不得不面对的问题是:阿霉素的剂量限制性心脏毒性和骨髓抑制限制其在临床广泛应用;阿霉素类同紫杉类骨髓毒性具有叠加作用,两者联合化疗往往给患者带来IV度骨髓抑制,时时威胁患者生命。近年来,随着肿瘤分子生物学的深入研究,人们对乳腺癌的发生、发展、信号传导机制有了较为深入的了解,发现了许多与乳腺癌发生发展密切相关的基因和蛋白,以这些基因分子为靶点的肿瘤靶向治疗也逐渐成为乳腺癌辅助治疗的热点,有些已经取得不错的成绩,比如针对雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性患者进行内分泌治疗,有效率可达50-60%。从疗效来看目前这些治疗手段仍不能取代化疗,同时还有一定的局限性,如ER、PR（-）乳腺癌患者内分泌治疗有效率不超过10%。乳腺癌的分子靶向治疗是指针对乳腺癌发生、发展有关的癌基因及其相关表达产物进行治疗。分子靶向药物通过阻断肿瘤细胞或相关细胞的信号转导,来控制细胞基因表达,从而抑制或杀伤肿瘤细胞。在众多基因中,针对人类表皮生长因子受体-2（HER-2）基因无疑是同类基因中颇为成功的一个范例。HER-2基因是位于染色体17q21,具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体。临床研究表明,20%-30%的乳腺癌中存在HER-2基因明显扩增和过表达,过表达者组织学分级高,分期晚,更容易发生实质性脏器转移,化疗后极少能够获得完全缓解。赫赛汀（Herceptin）是以乳腺癌HER-2基因作为治疗靶点的第一个分子靶向药物。它在临床上的应用已获得了巨大成就,已成为乳腺癌临床标准治疗不可分割的一部分,靶点明确,对正常机体无明显毒副作用,具有传统化疗所不具备的优越性。近年来,国内外临床上将目前乳腺癌化疗有效率最高的TAC方案同Herceptin一起用于HER-2阳性的乳腺癌患者,取得了可喜的成就。N9831和BCIRG006实验研究显示:采用环磷酰胺+阿霉素序贯多西他赛再序贯Herceptin模式（AC→T→H）与单纯辅助化疗相比,无病生存率和总生存率都明显提高。个中原因,是基因靶向治疗提高了化疗的敏感性,还是两者之间具有协同作用,很少有实验研究加以考证和探讨。若具有协同作用,能否在不降低化疗效果上减量,从而减轻Docetaxel+THP（DA）这个颇为有效率化疗方案的毒副作用,这些是临床所关注的问题。目的:用四唑蓝快速比色法（MTT）和细胞凋亡途径探讨验证DA联合Herceptin对乳腺癌细胞杀伤作用和可能机理,比较两者不同给药顺序对乳腺癌细胞杀伤作用的差异,为现行乳腺癌的化疗方案DA+ Herceptin提供实验依据开阔新的思路。方法:1.用免疫组化方法检测M453、M231两个细胞系HER-2表达情况,选取HER-2高表达细胞系进行实验。2.应用四氮唑蓝快速比色法（MTT）测定Docetaxel（D）、THP（A）对人乳腺癌细胞株M453作用24h、48h、72h的生长抑制率,采用Compusyn 1.0软件分析数据,绘制浓度-细胞抑制率曲线,计算IC50值。3.应用MTT法测定赫赛汀单独、联合、序贯Docetaxel（D）、THP（A）对人乳腺癌细胞株M453作用48h的生长抑制率,按金氏公式分析药物合并效应。4.用碘化丙啶（PI）渗入法测定单药,联合及不同序贯方式作用M453细胞48h,流式细胞仪各组细胞周期的变化。5. Annexin-V/FITC双标记法测定单药,联合及不同序贯方式作用M453细胞48h,流式细胞仪各组细胞早期凋亡率。6. Gimesa染色法处理,光镜下观察凋亡细胞形态。7.所有实验数据应用SPSS13.0软件包进行分析。单药作用采用Compusyn 1.0软件分析数据,绘制浓度-细胞抑制率曲线;检验浓度-抑制率曲线采用Microsoft Excel图表法;检验药物对细胞的抑制率、细胞周期分布、凋亡率,统计学方法采用t检验,计量资料用x±S表示。P<0.05有统计学意义。结果:1、免疫组化检测M453 HER-2高表达（3+）,M453不表达（-）。2、Docetaxel作用M453细胞24h、48h、72h IC₅₀值分别为80.4372 ug/ml、53.9763 ug/ml、26.2771 ug/ml;THP作用24h、48h、72h IC₅₀值分别为13.9195 ug/ml、5.8422 ug/ml、1.4973 ug/ml,呈时间浓度依赖效应。3、Docetaxel与THP IC₅₀浓度联合对M453细胞作用48h的IC₅₀值为0.95114ug/ml, Q值为0.87（+）;在1/4倍IC₅₀浓度联合Q值为1.19（++）;2倍IC₅₀浓度联合时Q值为0.83（-）。4、1/2倍IC₅₀浓度Herceptin联合IC₅₀浓度Docetaxel抑制率为53.35%,Q值为1.08（+）;1/4倍IC₅₀浓度Herceptin联合IC₅₀浓度Docetaxel、Docetaxel+THP抑制率分别为51.01%、61.95%,Q值分别为1.21（++）、1.17（++）。5、Docetaxel、THP、Docetaxel+THP序贯Herceptin抑制率为62.66%、85.47%、73.61%,Q值分别为0.94（+）、1.11（+）、0.84（-）,Herceptin序贯Docetaxel、THP、Docetaxel+THP抑制率为80.23%、66.85%、88.11%,Q值分别为1.08（+）、0.86（+）、0.97（+）。6、THP作用M453细胞使G₀/G₁、S期比例下降,G₂/M比例升高;Docetaxel作用后使G₀/G₁、S期比例下降,G₂/M比例上升;Docetaxel联合Herceptin表现为G₀/G₁比例增加,S期、G₂/M比例减少;THP联合Herceptin G₀/G₁、S期比例下降,G₂/M比例上升;Docetaxel+THP+Herceptin时G₀/G₁比例减少,S期、G₂/M比例增加。7、Herceptin序贯Docetaxel G₀/G₁比例升高,S期、G₂/M比例下降。Docetaxel序贯Herceptin则S期增加,G₂/M比例减少;THP序贯Herceptin使G_/G₁、S期比例进一步下降,G₂/M比例继续升高;而Herceptin序贯THP则G_/G₁比例升高,S期、G₂/M比例下降;Docetaxel+THP序贯Herceptin表现为G_/G₁比例下降,G₂/M比例升高。Herceptin序贯Docetaxel+THP则G_/G₁、S期比例进一步下降,G₂/M比例继续升高。8、Gimesa染色及光镜下观察不同处理方式下凋亡细胞形态不同。结论:1、Docetaxel、THP、Herceptin单药对乳腺癌M453细胞均出现不同程度的增殖抑制,Docetaxel、THP对HER-2阳性细胞强于阴性细胞;Docetaxel+THP联合Herceptin对M453细胞抑制作用强于Docetaxel +THP;0.31、0.75、1.6倍IC50浓度的Docetaxel+THP联合Herceptin分别同1/2、1、2倍IC50浓度的Docetaxel+THP对乳腺癌细胞抑制作用相当。2、Herceptin主要引起G₁期阻滞,Docetaxel主要作用G₂/M期,THP主要对S期敏感;Docetaxel联合THP凋亡率高于单药;Docetaxel+THP联合Herceptin凋亡率高于Docetaxel+THP。3、Herceptin与Docetaxel+THP的不同给药顺序会影响乳腺癌抑制增殖的效果;THP序贯Herceptin、Herceptin序贯Docetaxel对细胞的抑制作用强于反向序贯;Herceptin序贯Docetaxel+THP对细胞的抑制作用强于Docetaxel+THP序贯Herceptin。