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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病,主要的病理改变是中脑黑质投射到纹状体的多巴胺能神经元进行性缺失,引起黑质纹状体系统多巴胺水平降低。服用左旋多巴制剂的多巴胺替代治疗至今仍是早期最为有效的治疗方法,但其只是症状性治疗,远期疗效欠佳,出现严重的副作用,包括症状波动、异动症以及精神症状。细胞移植替代补充缺失的多巴胺能神经元,是目前帕金森病治疗的策略之一,其中胚胎腹侧中脑(fetal ventral mesencephalic,FVM)组织移植已经取得了成功,但是由于伦理束缚和来源限制,不能够得到广泛应用。骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)是骨髓内的一种多潜能干细胞,在一定的条件下,可以分化为神经细胞。而且它可以直接从个体骨髓中获得,来源充足,取材方便,且避免伦理学的束缚。因此BMSCs是治疗帕金森病理想的种子细胞。帕金森病黑质多巴胺能神经元变性的原因目前还不明确,然而大量的研究资料提示,其主要与氧化反应增强、线粒体功能异常等因素有关。谷胱甘肽作为脑内最重要的抗氧化剂,PD中还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)含量降低,并与其疾病的严重程度相关。应用GSH治疗早期PD已取得了一定的疗效。体外实验表明GSH可诱导BMSCs分化为神经组织细胞。本研究应用尿嘧啶脱氧核苷(Bromodeoxyuridine,Brdu)和Resovist双标记不同数量的BMSCs移植PD大鼠纹状体内,应用MRI对其进行活体示踪观察,免疫组化检测BMSCs在脑内的迁移及细胞的分化。并通过GSH干预,探讨联合应用骨髓基质细胞和还原型谷胱甘肽治疗帕金森病大鼠的疗效和机制。第一部分尿嘧啶脱氧核苷和Resovist双标记骨髓基质细胞移植帕金森病大鼠后细胞迁移范围研究目的:观察Brdu及Resovist双标记不同数量BMSCs单点移植入PD大鼠受损纹状体内,通过阿朴吗啡诱发旋转试验评价最佳移植数量,通过磁共振活体示踪、免疫组化检测BMSCs在脑内的迁移范围。方法:体外分离培养SD大鼠BMSCs,经Brdu和Resovist双标记后移植PD大鼠脑内。根据每注射点细胞数量及细胞是否铁标记,36只PD大鼠随机分成5组:1.0×105标记细胞组(n=8)、1.5×105标记细胞组(n=8)、2.0×105标记细胞组(n=8)、2.5×105标记细胞组(n=8)和对照组(n=4)。移植前1周和移植后1、4、8周进行阿朴吗啡诱发旋转试验和MRI动态示踪,第9周处死大鼠,进行Brdu免疫组化确定移植后细胞迁移范围。结果: (1)阿朴吗啡诱发旋转试验: 2.0×105移植组阿朴吗啡每分钟旋转次数降低幅度最大,与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。(2) MRI检查:T1WI和T2WI序列上可见移植区明显的低信号改变,并随着时间的推移发生广泛迁移,以第四周迁移最明显。(3) Brdu免疫组化: BMSCs移植后不但向周围纹状体组织近距离地迁移,而且沿着胼胝体、室管膜发生广泛的迁移。结论: Brdu和Resovist双标记BMSCs移植治疗PD大鼠后能够存活较长时间(至少9周以上)并发生广泛迁移,2.0×105BMSCs移植组明显改善大鼠的行为学表现,细胞迁移的结果最优。第二部分尿嘧啶脱氧核苷和Resovist双标记骨髓基质细胞移植帕金森病大鼠后细胞分化研究目的: Brdu及Resovist双标记不同数量BMSCs移植入PD大鼠受损纹状体内,通过免疫组化双染和实时荧光定量PCR检测移植后细胞的分化方向。方法:体外分离培养SD大鼠BMSCs,经Brdu和Resovist双标记后移植PD大鼠右侧纹状体内,根据每注射点细胞数量以及细胞是否铁标记,36只PD大鼠随机分成5组:1.0×105标记细胞组(n=8)、1.5×105标记细胞组(n=8)、2.0×105标记细胞组(n=8)、2.5×105标记细胞组(n=8)和对照组(n=4)。移植后第9周进行免疫组化双染确定移植后细胞分化,并运用实时荧光定量PCR进行定量检测。结果:免疫组化双染:移植的BMSCs可以向星型胶质细胞、神经干细胞、成熟神经元以及多巴胺能细胞分化,以向星型胶质细胞的分化相对较多。(3)荧光实时定量PCR: 2.0×105移植组GFAP、Nestin、NSE及TH mRNA的转录水平均为最高。五组之间只有2.0×105移植组和1.5×105移植组GFAP mRNA、Nestin mRNA、NSE mRNA、TH mRNA的转录水平较对照组有统计学差异,其余各组与对照组比较无统计学差异。结论: BMSCs移植后可以分化为功能性的神经细胞,以2.0×105移植组分化的结果最优。第三部分还原型谷胱甘肽对帕金森病大鼠纹状体移植BMSCs的诱导分化及疗效作用的研究目的:研究还原型谷胱苷肽(Reduced glutathione ,GSH)对帕金森病大鼠纹状体移植BMSCs的诱导分化及疗效影响。方法:在第一部分和第二部分的基础上,选择最佳移植细胞数量2.0×105移植PD大鼠,体内每天腹腔注射GSH125mg/kg,对照组注射等量生理盐水。第7周进行免疫组化双染和实时荧光定量PCR,评估还原型谷胱甘肽的神经保护作用。结果: BMSCs+GSH组旋转次数减少幅度显著大于BMSCs组和对照组。实时荧光定量PCR显示BMSCs+GSH组的GFAP、NSE及TH mRNA的转录水平均较高,而BMSCs+GSH组与单纯的BMSCs治疗组的Nestin mRNA的转录水平无统计学差异。通过免疫组化双染两组均显示一部分Brdu阳性细胞同时表达GFAP、Nestin、NSE或TH阳性细胞,以Brdu和GFAP双阳性细胞表达最多,且BMSCs+GSH组分化细胞数量多于单纯BMSCs治疗组。结论:联合使用BMSCs和还原型谷胱甘肽优于单纯的BMSCs治疗PD大鼠,还原型谷胱甘肽可使大鼠的行为学明显改善,增加PD大鼠纹状体内移植的BMSCs向神经组织细胞分化。