1.研究目的及意义肝损伤是临床常见的危害人类健康的疾病，它是多种肝脏疾病共同存在的病理生理过程，对其进行早期防治，可以预防肝脏纤维化、肝硬化、甚至肝脏肿瘤的产生。而目前对肝损伤的机制已经进行了大量的研究，同时也发现许多中药具有保护肝细胞膜稳定性、调节机体免疫功能、改善肝脏血液循环等功能，因此我们希望通过实验研究能够发现治疗肝炎及其并发症的一种新的药物方案。四逆汤（si n i decoction, SND)出自《伤寒论》，治少阴、四肢厥逆、急性虚脱证。大量药理研究报道SND具有较强的清除自由基、抗氧化、改善微循环、免疫调节、抗肿瘤等多种药理作用。本课题组主要利用其免疫调节作用，观察此作用是否能阻止急性炎症是我们探索的重点。因此，依据导师的临床经验，本课题在原方基础上加入具有调节免疫功能、抗衰老功效的山茱萸组成以抗炎、免疫调节为主的加味四逆汤。近年来，刀豆蛋白A(ConA)复制的由T淋巴细胞介导的小鼠急性肝损伤模型被认为是肝炎机制研究和新药筛选的可靠动物模型，据此本实验采用刀豆蛋白A建立了急性免疫性肝损伤动物模型，利用酶联免疫法、免疫组化、Flow Cytometry等技术对加味四逆汤抗肝损伤作用和机制进行初步探讨，为临床用药提供一定的实验依据。2.方法将健康雌性NIH小鼠50只，随机分为5组:正常对照组，ConA模型组，联苯双酯组，加味四逆汤大、小剂量组。所有的小鼠均尾静脉注射刀豆蛋白A（18mg.kg-1）来建立急性免疫性肝损伤动物模型，在造模成功后摘取小鼠眼球采血，用酶联免疫法检测小鼠血清中门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量以及血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的活性，并取小鼠部分肝脏组织运用嗜伊红（HE）染色观察肝组织病理学形态，免疫组化法观察肝脏组织Fas抗原的表达。最后我们运用了流式细胞技术定量检测各组小鼠循环血液中CD4+、8+T淋巴细胞亚群的比例及活化状态。所有实验数据均用均数±标准差表示，实验各组间效果的比较用单因素方差分析，数据的统计出来用SPSS13.0软件处理，P＜0.05为有意义。3.结果3.1小鼠一般情况的观察：正常对照组小鼠精神活动状态良好，毛发光滑无明显减少，饮食及大小便情况如旧；Con A模型动物组表现为毛发减少、行动迟缓，精神萎靡、蜷卧、乏力、纳差、尿液发黄、大便溏泄。而阳性药物组及加味四逆汤大、小剂量组部分小鼠亦出现上述症状及体征，但出现时间较模型组延迟，且随药物剂量的增加，上述症状和体征逐渐减轻。3.2加味四逆汤对Con A免疫性肝损伤小鼠的保护作用小鼠尾静脉注射Con A造模后，模型组血清转氨酶ALT及AST活性水平升高，解剖小鼠肉眼观察模型组小鼠肝脏体积增大，被膜肿胀，边缘变钝，呈暗红色，表面可见点状及片状的出血坏死点，脾脏也有明显淤血肿大。模型组小鼠肝脏指数明显高于生理盐水对照组，且差异有显著性统计学意义(P<0.05)。光镜下可见正常组小鼠整个肝小叶结构完整，肝脏细胞基本无气球样变性和病理性坏死、凋亡，肝脏内无炎症细胞浸润。模型组肝小叶结构大部分被破坏，在肝组织中央可见大量的碎片状坏死和或气球样变性，此外还有许多嗜伊红类圆形的凋亡肝细胞存在，并可见大量肝枯否细胞增生和炎症淋巴细胞的浸润;而各药物组小鼠肝组织结构基本存在，肝细胞病理性坏死和炎症细胞浸润明显减少。以上结果表明实验小鼠在注射Con A后，诱导了明显的肝损伤。而加味四逆汤大、小剂量组均有减轻血清转氨酶活性水平，抑制炎性细胞的激活和细胞因子的分泌，并减轻肝脏细胞的病理性坏死和凋亡，对Con A诱导的肝脏损伤程度具有一定的治疗作用，且成明显的量效关系。本实验结果为加味四逆汤抗免疫性肝损伤作用提供了动物实验依据，在接下来的工作中我们会对其作用机制作进一步的研究。3.3加味四逆汤对肝损伤小鼠循环血中CD4+、CD8+T淋巴细胞的作用实验结果说明与正常组比较，各模型组小鼠循环血液中CD4+、CD8+T淋巴细胞比率有明显减低,且差异具有统计学意义(P <0.05);与模型组比较，药物组小鼠循环血中CD4+、CD8+淋巴细胞的升高率也具有明显差异(P<0.05），此结果表明加味四逆汤通过升高急性免疫性肝损伤中小鼠循环血液中CD4+、CD8+淋巴细胞比率,降低淋巴细胞在肝脏内的数目，从而减少其肝脏的炎症破坏作用。3.4加味四逆汤对肝损伤小鼠细胞凋亡的影响结果表明模型组血清中TNF-α含量进行性升高，与对照组、药物组比较均有差异（P<0.05）。模型组Fas抗原大量表达在肝细胞膜上，尤其是在碎屑样坏死和或桥接样坏死周围淋巴细胞浸润区域的肝细胞膜上表达明显。对照组和药物组血清中TNF-α水平变化不大，肝细胞F as抗原表达不明显。据上说明加味四逆汤能够干预Con A小鼠肝脏组织F as抗原和血清TNF-α水平的表达，对急性肝损伤的细胞凋亡有较好的保护作用。4.结论加味四逆汤通过活化外周血CD4+、CD8+T细胞的含量及其活性，减少细胞毒性T淋巴细胞向肝脏内浸润；抑制小鼠血清肿瘤坏死因子水平和肝细胞Fas抗原的表达，从而阻断肝细胞病理性坏死和凋亡，对肝组织具有一定的保护作用，这为突破中药传统方剂的应用和临床肝炎治疗提供了新的治疗方案。