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研究背景
结肠癌是全球范围内常见恶性肿瘤之一，是人类排名第三的常见癌症，其具有较高的发病率及死亡率较高。随着生活方式和饮食习惯的调整，结肠癌的发病率逐年增加，并且在中国越来越年轻。像大多数恶性肿瘤一样，结肠癌的发病机理也不是很清楚。目前，结肠癌被认为是环境因素和遗传因素共同作用的结果。研究表明，影响结肠癌发病率的主要因素包括环境，肠内稳态，饮食，烟酒成瘾和体育锻炼。结肠癌的治疗仍然主要是外科手术，化学疗法和放射疗法是辅助的。为了达到治疗效果，结肠癌患者之间存在明显的个体差异。在晚期结肠癌患者中，上述疗法的缺陷是明显的，往往导致预后不良。结肠癌的术后转移主要包括血液学转移、腹膜转移和远处淋巴结转移，并常伴有局部复发。结肠癌的生存率与临床阶段密切相关，无转移、局部转移和远处转移的患者的5年生存率分别为90％，70％和10％。因此，寻找早期诊断的标志物并探索参与结肠癌生长和转移的分子机制是当前研究的重点。
G2/S期应答相关蛋白1(GTSE1)是人类gtse1基因编码的一种细胞周期相关蛋白，主要调控G1/S细胞周期的转变。近年来的研究表明，GTSE1与癌细胞存活、转移行为和化疗耐药性有关。已经证明GTSE1与包括顺铂、5‐氟尿嘧啶和阿霉素等多种耐药性相关。随着GTSE1在肿瘤中的作用越来越受到重视，GTSE1已被证实在多种癌症的发生发展进程中发挥着举足轻重的作用。然而GTSE1在结肠癌的生物学过程中所发挥作用的分子机制目前尚不明确。
有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是调控多种细胞过程的关键信号通路，包括增殖、分化、凋亡和应激反应。MAPK通路包括三个主要激酶：MAPK、MAPK激酶(MKK )和MAPK激酶激酶(MKKK)，它们激活和磷酸化下游蛋白。细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2在进化上是保守的，普遍存在的丝氨酸-苏氨酸激酶在正常和病理条件下调节细胞信号。ERK表达对肿瘤的发生发展至关重要，ERK的过度激活在肿瘤的发生发展中起重要作用。Ras/Raf/MAPK(MEK)/ERK通路是MAPK信号转导通路中最重要的信号级联，对肿瘤细胞的生存和发展起着至关重要的作用。
研究目的
越来越多的证据表明GTSE1在多种肿瘤的发生和发展过程中发挥着作用的作用，然而GTSE1在结肠癌的发展进程中所起到的作用及深入的分子机制目前尚不清楚，鉴于细胞信号通路的激活对于肿瘤的发生发展至关重要，本研究旨在探讨GTSE1对结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭的作用影响，其发挥生物学功能所用所涉及的细胞信号通路，及其特异的分子生物学机制。为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的生物学作用靶点。
研究方法
第一部分GTSE1在结肠癌组织及细胞中高表达并促进结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭
1.对结肠癌组织芯片进行免疫组化，分析GTSE1在结肠癌组织及癌旁正常组织的相对表达量。利用TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-g enomics/tcga)提取结肠癌样品及对应的癌旁组织样品相关数据，对其进行生物信息学分析，验证GTSE1在结肠癌组织及癌旁正常组织的相对表达量，同时运用qRT-PCR实验技术对其进行进一步验证。利用Westernbolt实验技术分析GTSE1在结肠癌各种细胞系中的表达量。
2.为探索GTSE1对结肠癌细胞的作用影响，运用慢病毒感染的实验技术将实验分为阴性对照组(NC组)、低表达GTSE1组(GTSE1-D组)、过表达GTSE1组(GTSE1-U组)、空载实验组(Vector组)四组。
3.运用CCK-8实验及Edu细胞增殖实验探索GTSE1的表达对结肠癌细胞增殖活力的影响。流式细胞术检测细胞周期以观察GTSE1对结肠癌细胞周期的影响。同时使用细胞划痕技术及Transwell实验技术观察GTSE1对结肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响。
4.裸鼠体外成瘤实验，模拟体内环境，探索GTSE1在体内对结肠癌细胞增殖活力的影响。并通过对结肠癌组织样本进行免疫组化，观察GTSE1对肿瘤细胞增殖指标KI67及PCNA表达量的影响。
第二部分GTSE1通过激活MAPK信号通路促进结肠癌细胞的增殖及侵袭迁移
1.使用PathScan抗体芯片技术检测结肠癌细胞中GTSE1下游通路。
2.运用Westernbolt实验技术探索GTSE1表达对MAPK信号通路蛋白及MAPK信号通路下游靶基因表达的影响。
3.运用免疫共沉淀的实验技术，验证GTSE1与MAPK信号通路关键蛋白的作用关系。
4.运用免疫组化技术验证GTSE1表达与MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平的关系。
5.使用MEK-ERK信号通路阻滞剂U0126、AZD6244阻断信号通路后，运用CCK-8及Edu细胞增殖实验观察结肠癌细胞的增殖活力。使用细胞划痕实验及Transwell实验技术观察阻断MEK-ERK信号通路后，上调GTSE1的表达对结肠癌细胞的迁移能力和侵袭能力的影响。
第三部分ELK1转录激活GTSE1
1.通过使用siRNA及对应NC化学模拟物转染将实验分为四组，即空载实验组(Vector组)、过表达ELK1组(ELK1组)、阴性对照组(siNC组)、低表达ELK1组(siELK1)，探讨ELK1对GTSE1的影响作用。通过采用Westernbolt实验技术及qRT-PCR技术观察ELK1对GTSE1表达的影响。
2.通过运用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)预测转录因子结合位点，进一步明确ELK1转录激活GTSE1的分子机制。
3.通过运用染色质免疫共沉淀(CHIP)的实验技术进一步明确ELK1可与GTSE1的启动子区域结合。
4.通过运用TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-g enomics/tcga)获取ELK1及GTSE1的转录组数据，再次验证ELK1与GTSE1的转录关系。
统计分析
使用GraphPadPrism5.0软件进行统计分析。测量数据表示为(x±s)。使用独立样本t检验进行组之间的成对比较。使用Kruskal-Wallis检验用于比较三组或三组以上数据之间的差异。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001表示统计结果的差异具有统计学意义。
研究结果
第一部分
1.组织芯片的免疫组化及TCGA数据库的生物信息学分析结果表明GTSE1在结肠癌组织中高表达。qRT-PCR实验技术也表明在结肠癌组织中，GTSE1表现出高表达现象。Westernbolt实验技术鉴定出GTSE1在结肠癌各细胞系中表达量均升高。
2.通过慢病毒感染，过表达GTSE1和下调GTSE1的表达，以探索GTSE1对结肠癌细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的影响。CCK-8实验技术及Edu细胞增殖实验技术均表明GTSE1过表达可以促进结肠癌细胞的增殖活力。流式细胞术检测细胞周期结果发现干扰结肠癌细胞的GTSE1表达可以诱导结肠癌细胞发生细胞周期G1阻滞。细胞划痕技术及Transwell实验技术表明过表达GTSE1会增加结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。
3.裸鼠皮下成瘤实验结果发现上调GTSE1的表达可以促进人结肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力，裸鼠体质量较Vector组明显下调。而下调GTSE1的表达，裸鼠体质量明显上调，肿瘤体积相较与NC组较小。同时结肠癌组织样本的免疫组化结果显示：上调GTSE1的表达，肿瘤细胞增殖指标KI67及PCNA表达量也随之增加。
第二部分
1.PathScan抗体芯片检测提示GTSE1可能与MAPK信号通路的活化显著相关。
2.Westernbolt实验结果表明上调GTSE1的表达可以促进MAPK信号通路蛋白的磷酸化及MAPK信号通路下游靶基因的表达。
3.免疫共沉淀的实验显示GTSE1与MAPK信号通路关键蛋白ERK、AKT直接相互作用，验证了GTSE1与MAPK信号通路相互作用关系。
4.免疫组化验证GTSE1表达与MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平呈正相关
5.阻断MAPK信号通路可以逆转GTSE1过表达所促进的结肠癌细胞迁移及侵袭能力增强的效应。
第三部分
1.Westernbolt实验及qRT-PCR实验结果显示：与空载实验组(Vector组)相比，过表达ELK1组(ELK1组)对应的GTSE1表达量表现出上调现象。而与阴性对照组(siNC组)相比，低表达ELK1组(siELK1)组中的GTSE1表达明显下降。
2.JASPAR数据库预测结果表明ELK1启动子结合序列为CCGGAAG。ELK1能够和GTSE1的启动子中的四个位点结合。
3.染色质免疫共沉淀(CHIP)的实验提示ELK1可与GTSE1的启动子区域结合。
4.获取TCGA数据库中信息进行分析表明ELK1与GTSE1成线性正相关的关系。
结论
1.GTSE1在结肠癌细胞及组织中表现出高表达现象。
2.GTSE1能够促进结肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移。下调GTSE1的表达可以使结肠癌细胞阻滞于细胞周期G1期。
3.GTSE1与MAPK信号通路的活化显著相关，并与MAPK信号通路相关蛋白磷酸化及MAPK信号通路下游靶基因的表达呈正相关。
4.GTSE1通过激活MAPK信号通路促进结肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移。
5.ELK1作为GTSE1上游转录因子，激活GTSE1的表达。
结肠癌是全球范围内常见恶性肿瘤之一，是人类排名第三的常见癌症，其具有较高的发病率及死亡率较高。随着生活方式和饮食习惯的调整，结肠癌的发病率逐年增加，并且在中国越来越年轻。像大多数恶性肿瘤一样，结肠癌的发病机理也不是很清楚。目前，结肠癌被认为是环境因素和遗传因素共同作用的结果。研究表明，影响结肠癌发病率的主要因素包括环境，肠内稳态，饮食，烟酒成瘾和体育锻炼。结肠癌的治疗仍然主要是外科手术，化学疗法和放射疗法是辅助的。为了达到治疗效果，结肠癌患者之间存在明显的个体差异。在晚期结肠癌患者中，上述疗法的缺陷是明显的，往往导致预后不良。结肠癌的术后转移主要包括血液学转移、腹膜转移和远处淋巴结转移，并常伴有局部复发。结肠癌的生存率与临床阶段密切相关，无转移、局部转移和远处转移的患者的5年生存率分别为90％，70％和10％。因此，寻找早期诊断的标志物并探索参与结肠癌生长和转移的分子机制是当前研究的重点。
G2/S期应答相关蛋白1(GTSE1)是人类gtse1基因编码的一种细胞周期相关蛋白，主要调控G1/S细胞周期的转变。近年来的研究表明，GTSE1与癌细胞存活、转移行为和化疗耐药性有关。已经证明GTSE1与包括顺铂、5‐氟尿嘧啶和阿霉素等多种耐药性相关。随着GTSE1在肿瘤中的作用越来越受到重视，GTSE1已被证实在多种癌症的发生发展进程中发挥着举足轻重的作用。然而GTSE1在结肠癌的生物学过程中所发挥作用的分子机制目前尚不明确。
有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是调控多种细胞过程的关键信号通路，包括增殖、分化、凋亡和应激反应。MAPK通路包括三个主要激酶：MAPK、MAPK激酶(MKK )和MAPK激酶激酶(MKKK)，它们激活和磷酸化下游蛋白。细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2在进化上是保守的，普遍存在的丝氨酸-苏氨酸激酶在正常和病理条件下调节细胞信号。ERK表达对肿瘤的发生发展至关重要，ERK的过度激活在肿瘤的发生发展中起重要作用。Ras/Raf/MAPK(MEK)/ERK通路是MAPK信号转导通路中最重要的信号级联，对肿瘤细胞的生存和发展起着至关重要的作用。
研究目的
越来越多的证据表明GTSE1在多种肿瘤的发生和发展过程中发挥着作用的作用，然而GTSE1在结肠癌的发展进程中所起到的作用及深入的分子机制目前尚不清楚，鉴于细胞信号通路的激活对于肿瘤的发生发展至关重要，本研究旨在探讨GTSE1对结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭的作用影响，其发挥生物学功能所用所涉及的细胞信号通路，及其特异的分子生物学机制。为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的生物学作用靶点。
研究方法
第一部分GTSE1在结肠癌组织及细胞中高表达并促进结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭
1.对结肠癌组织芯片进行免疫组化，分析GTSE1在结肠癌组织及癌旁正常组织的相对表达量。利用TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-g enomics/tcga)提取结肠癌样品及对应的癌旁组织样品相关数据，对其进行生物信息学分析，验证GTSE1在结肠癌组织及癌旁正常组织的相对表达量，同时运用qRT-PCR实验技术对其进行进一步验证。利用Westernbolt实验技术分析GTSE1在结肠癌各种细胞系中的表达量。
2.为探索GTSE1对结肠癌细胞的作用影响，运用慢病毒感染的实验技术将实验分为阴性对照组(NC组)、低表达GTSE1组(GTSE1-D组)、过表达GTSE1组(GTSE1-U组)、空载实验组(Vector组)四组。
3.运用CCK-8实验及Edu细胞增殖实验探索GTSE1的表达对结肠癌细胞增殖活力的影响。流式细胞术检测细胞周期以观察GTSE1对结肠癌细胞周期的影响。同时使用细胞划痕技术及Transwell实验技术观察GTSE1对结肠癌细胞迁移及侵袭能力的影响。
4.裸鼠体外成瘤实验，模拟体内环境，探索GTSE1在体内对结肠癌细胞增殖活力的影响。并通过对结肠癌组织样本进行免疫组化，观察GTSE1对肿瘤细胞增殖指标KI67及PCNA表达量的影响。
第二部分GTSE1通过激活MAPK信号通路促进结肠癌细胞的增殖及侵袭迁移
1.使用PathScan抗体芯片技术检测结肠癌细胞中GTSE1下游通路。
2.运用Westernbolt实验技术探索GTSE1表达对MAPK信号通路蛋白及MAPK信号通路下游靶基因表达的影响。
3.运用免疫共沉淀的实验技术，验证GTSE1与MAPK信号通路关键蛋白的作用关系。
4.运用免疫组化技术验证GTSE1表达与MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平的关系。
5.使用MEK-ERK信号通路阻滞剂U0126、AZD6244阻断信号通路后，运用CCK-8及Edu细胞增殖实验观察结肠癌细胞的增殖活力。使用细胞划痕实验及Transwell实验技术观察阻断MEK-ERK信号通路后，上调GTSE1的表达对结肠癌细胞的迁移能力和侵袭能力的影响。
第三部分ELK1转录激活GTSE1
1.通过使用siRNA及对应NC化学模拟物转染将实验分为四组，即空载实验组(Vector组)、过表达ELK1组(ELK1组)、阴性对照组(siNC组)、低表达ELK1组(siELK1)，探讨ELK1对GTSE1的影响作用。通过采用Westernbolt实验技术及qRT-PCR技术观察ELK1对GTSE1表达的影响。
2.通过运用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)预测转录因子结合位点，进一步明确ELK1转录激活GTSE1的分子机制。
3.通过运用染色质免疫共沉淀(CHIP)的实验技术进一步明确ELK1可与GTSE1的启动子区域结合。
4.通过运用TCGA数据库(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-g enomics/tcga)获取ELK1及GTSE1的转录组数据，再次验证ELK1与GTSE1的转录关系。
统计分析
使用GraphPadPrism5.0软件进行统计分析。测量数据表示为(x±s)。使用独立样本t检验进行组之间的成对比较。使用Kruskal-Wallis检验用于比较三组或三组以上数据之间的差异。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001表示统计结果的差异具有统计学意义。
研究结果
第一部分
1.组织芯片的免疫组化及TCGA数据库的生物信息学分析结果表明GTSE1在结肠癌组织中高表达。qRT-PCR实验技术也表明在结肠癌组织中，GTSE1表现出高表达现象。Westernbolt实验技术鉴定出GTSE1在结肠癌各细胞系中表达量均升高。
2.通过慢病毒感染，过表达GTSE1和下调GTSE1的表达，以探索GTSE1对结肠癌细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的影响。CCK-8实验技术及Edu细胞增殖实验技术均表明GTSE1过表达可以促进结肠癌细胞的增殖活力。流式细胞术检测细胞周期结果发现干扰结肠癌细胞的GTSE1表达可以诱导结肠癌细胞发生细胞周期G1阻滞。细胞划痕技术及Transwell实验技术表明过表达GTSE1会增加结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。
3.裸鼠皮下成瘤实验结果发现上调GTSE1的表达可以促进人结肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力，裸鼠体质量较Vector组明显下调。而下调GTSE1的表达，裸鼠体质量明显上调，肿瘤体积相较与NC组较小。同时结肠癌组织样本的免疫组化结果显示：上调GTSE1的表达，肿瘤细胞增殖指标KI67及PCNA表达量也随之增加。
第二部分
1.PathScan抗体芯片检测提示GTSE1可能与MAPK信号通路的活化显著相关。
2.Westernbolt实验结果表明上调GTSE1的表达可以促进MAPK信号通路蛋白的磷酸化及MAPK信号通路下游靶基因的表达。
3.免疫共沉淀的实验显示GTSE1与MAPK信号通路关键蛋白ERK、AKT直接相互作用，验证了GTSE1与MAPK信号通路相互作用关系。
4.免疫组化验证GTSE1表达与MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平呈正相关
5.阻断MAPK信号通路可以逆转GTSE1过表达所促进的结肠癌细胞迁移及侵袭能力增强的效应。
第三部分
1.Westernbolt实验及qRT-PCR实验结果显示：与空载实验组(Vector组)相比，过表达ELK1组(ELK1组)对应的GTSE1表达量表现出上调现象。而与阴性对照组(siNC组)相比，低表达ELK1组(siELK1)组中的GTSE1表达明显下降。
2.JASPAR数据库预测结果表明ELK1启动子结合序列为CCGGAAG。ELK1能够和GTSE1的启动子中的四个位点结合。
3.染色质免疫共沉淀(CHIP)的实验提示ELK1可与GTSE1的启动子区域结合。
4.获取TCGA数据库中信息进行分析表明ELK1与GTSE1成线性正相关的关系。
结论
1.GTSE1在结肠癌细胞及组织中表现出高表达现象。
2.GTSE1能够促进结肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移。下调GTSE1的表达可以使结肠癌细胞阻滞于细胞周期G1期。
3.GTSE1与MAPK信号通路的活化显著相关，并与MAPK信号通路相关蛋白磷酸化及MAPK信号通路下游靶基因的表达呈正相关。
4.GTSE1通过激活MAPK信号通路促进结肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移。
5.ELK1作为GTSE1上游转录因子，激活GTSE1的表达。