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慢性粒细胞白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，占成人白血病的15%~20%。在CML病人中，95%是由于BCR-ABL融合基因诱导产生的，BCR-ABL是由9号和22染色体易位而产生的融合基因，编码一个持续活化的酪氨酸激酶，能诱导CML的发生。针对BCR-ABL开发的靶向药物Imatinib取得了较好的临床疗效，使无法进行造血干细胞移植的病人病程得以控制，但Imatinib并不能治愈CML，因为这类药物长期应用易造成BCR-ABL基因突变而产生耐药性，并且也无法清除白血病干细胞（leukemia stem cells, LSCs），进而使疾病缓解后又最终复发，因此寻找BCR-ABL激酶以外的药物新靶点和清除LSCs才是治愈CML的关键。RacGTPs是近年来CML研究的一类热点基因，它位于BCR-ABL的下游，通过调控Ras/MAP、PI3K/Akt、FAK和Stat5等信号传导以及Bcl-XL等基因表达来促进CML细胞的增殖、迁移和耐药等。在RacGTPs基因家族中，与CML关系研究最多的是Rac1，Rac1活化对BCR-ABL诱导的CML发生、白血病细胞耐药和体内维持LSCs微环境都有非常关键的作用。然而BCR-ABL调控Rac1活化的作用机制至今仍然没有阐述清楚。近年来另一种小GTP结合蛋白ARF6，被发现能够通过自身活化与失活状态调节Rac1活性，ARF6是否介导了BCR-ABL-Rac1信号通路以及ARF6在BCR-ABL诱导的CML中是否发挥关键作用，成为本课题研究的出发点。基于这些疑问，本课题将运用分子生物学、细胞生物学和遗传学等实验方法和手段，从分子水平上探讨ARF6在BCR-ABL诱导的CML中的作用及可能的分子机制，对揭示CML的发病机制和寻找新的药物靶点具有重要的意义。为了研究ARF6在BCR-ABL诱导的CML中的作用，本实验首先建立了ARF6沉默的K562细胞系（shARF6），通过与对照组细胞系（ARF6-NC）比较，研究ARF6对K562细胞增殖、生存、分化和耐药的影响，并对其促进K562细胞增殖和耐药的分子机制进行了初步研究。一、ARF6对K562细胞增殖、生存、分化和耐药的影响方法：1.采用CFU检测ARF6沉默对K562细胞克隆形成能力的影响。2.采用CCK8检测ARF6沉默对K562细胞增殖及对药物的敏感性。3.采用AnnexinV染色检测ARF6沉默对K562细胞生存的影响。4.采用CD14表达分析和吉姆萨染色研究ARF6对K562细胞分化的影响。结果：1. CFU结果显示shARF6实验组克隆数量明显少于ARF6-NC对照组。2.CCK8结果显示shARF6实验组细胞增殖速度明显低于对照组的增殖速度；shARF6实验组对Imatinib和Ara-c的敏感性明显高于对照组。3.AnnexinV染色结果显示shARF6实验组凋亡率与对照组相比无明显差异。4. CD14表达分析结果显示shARF6实验组CD14阳性率与ARF6-NC对照组相比无明显差异，吉姆萨染色结果进一步说明shARF6实验组没有出现明显的细胞核分化特征。二、ARF6促进K562细胞增殖和耐药的分子机制研究方法：运用Western Blot方法检测ARF6沉默对Stat5、ERK和AKT等信号传导的影响及对cyclinB1、c-Myc、p21和A1等基因表达的调控。结果：与对照组相比，ARF6沉默抑制了Stat5和AKT磷酸化，但不影响ERK磷酸化；ARF6沉默上调了p21基因表达，下调了cyclinB1、c-Myc和A1等基因表达。结论ARF6促进K562细胞增殖和克隆形成能力，并增强K562细胞对Imatinib和Ara-c等药物的抗性，初步的研究结果显示这些作用是通过活化STAT5和AKT2条信号通路，调控c-Myc、cyclin B1、p21和A1等基因表达实现的。