论文部分内容阅读
慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病,占成人白血病的15%~20%。在CML病人中,95%是由于BCR-ABL融合基因诱导产生的,BCR-ABL是由9号和22染色体易位而产生的融合基因,编码一个持续活化的酪氨酸激酶,能诱导CML的发生。针对BCR-ABL开发的靶向药物Imatinib取得了较好的临床疗效,使无法进行造血干细胞移植的病人病程得以控制,但Imatinib并不能治愈CML,因为这类药物长期应用易造成BCR-ABL基因突变而产生耐药性,并且也无法清除白血病干细胞(leukemia stem cells, LSCs),进而使疾病缓解后又最终复发,因此寻找BCR-ABL激酶以外的药物新靶点和清除LSCs才是治愈CML的关键。RacGTPs是近年来CML研究的一类热点基因,它位于BCR-ABL的下游,通过调控Ras/MAP、PI3K/Akt、FAK和Stat5等信号传导以及Bcl-XL等基因表达来促进CML细胞的增殖、迁移和耐药等。在RacGTPs基因家族中,与CML关系研究最多的是Rac1,Rac1活化对BCR-ABL诱导的CML发生、白血病细胞耐药和体内维持LSCs微环境都有非常关键的作用。然而BCR-ABL调控Rac1活化的作用机制至今仍然没有阐述清楚。近年来另一种小GTP结合蛋白ARF6,被发现能够通过自身活化与失活状态调节Rac1活性,ARF6是否介导了BCR-ABL-Rac1信号通路以及ARF6在BCR-ABL诱导的CML中是否发挥关键作用,成为本课题研究的出发点。基于这些疑问,本课题将运用分子生物学、细胞生物学和遗传学等实验方法和手段,从分子水平上探讨ARF6在BCR-ABL诱导的CML中的作用及可能的分子机制,对揭示CML的发病机制和寻找新的药物靶点具有重要的意义。为了研究ARF6在BCR-ABL诱导的CML中的作用,本实验首先建立了ARF6沉默的K562细胞系(shARF6),通过与对照组细胞系(ARF6-NC)比较,研究ARF6对K562细胞增殖、生存、分化和耐药的影响,并对其促进K562细胞增殖和耐药的分子机制进行了初步研究。一、ARF6对K562细胞增殖、生存、分化和耐药的影响方法:1.采用CFU检测ARF6沉默对K562细胞克隆形成能力的影响。2.采用CCK8检测ARF6沉默对K562细胞增殖及对药物的敏感性。3.采用AnnexinV染色检测ARF6沉默对K562细胞生存的影响。4.采用CD14表达分析和吉姆萨染色研究ARF6对K562细胞分化的影响。结果:1. CFU结果显示shARF6实验组克隆数量明显少于ARF6-NC对照组。2.CCK8结果显示shARF6实验组细胞增殖速度明显低于对照组的增殖速度;shARF6实验组对Imatinib和Ara-c的敏感性明显高于对照组。3.AnnexinV染色结果显示shARF6实验组凋亡率与对照组相比无明显差异。4. CD14表达分析结果显示shARF6实验组CD14阳性率与ARF6-NC对照组相比无明显差异,吉姆萨染色结果进一步说明shARF6实验组没有出现明显的细胞核分化特征。二、ARF6促进K562细胞增殖和耐药的分子机制研究方法:运用Western Blot方法检测ARF6沉默对Stat5、ERK和AKT等信号传导的影响及对cyclinB1、c-Myc、p21和A1等基因表达的调控。结果:与对照组相比,ARF6沉默抑制了Stat5和AKT磷酸化,但不影响ERK磷酸化;ARF6沉默上调了p21基因表达,下调了cyclinB1、c-Myc和A1等基因表达。结论ARF6促进K562细胞增殖和克隆形成能力,并增强K562细胞对Imatinib和Ara-c等药物的抗性,初步的研究结果显示这些作用是通过活化STAT5和AKT2条信号通路,调控c-Myc、cyclin B1、p21和A1等基因表达实现的。