研究背景和目的作为重要的中枢免疫器官,胸腺在青春期后开始退化,并由胸腺上皮细胞(Thymic Epithelial cells,TECs)逐渐丧失引起。胸腺随着年龄的增长出现增龄性萎缩,主要表现为体积缩小,T细胞输出下降,胸腺上皮细胞减少,脂肪细胞增加等。与年龄相关的胸腺退化代表了衰老免疫系统最可识别的特征之一,并且被认为对免疫衰老具有重要作用。免疫衰老与胸腺萎缩密切相关,这与老化胸腺中凋亡细胞数量的增加和衰老细胞增加相关,这些导致了 T细胞输出下降和胸腺退化。研究表明,成年小鼠胸腺存在上皮祖细胞(Thymic epithelial progenitorcells,TEPC)。TEPC和/或干细胞的存在是该领域长期争论的主题。Nanog(Homeobox transcription factor Nanog)是一种含有同源异域结构域的转录因子,Nanog的多能性相关特性已应用于细胞重编程,以生成诱导性多能干细胞或引起代谢变化。最近的研究表明,Nanog在调节干细胞多能性中起重要作用。同时,Nanog的过表达导致寿命的显著延长。Sox2和Nanog是干细胞转录因子,调控着干细胞的自我更新及其分化过程。Sox2(Sex determining region Y-box2)是SOX家族的干细胞转录因子,SOX基因以限制性的时空方式表达,并且参与干细胞生物学,器官发生和发育,起到赋予成年干细胞特性的作用。Sox2在胚胎干细胞中调节和维持自我更新和多能性,且Sox2在小鼠胚胎后期的祖细胞中表达。Sox2不仅在干细胞和祖细胞中表达,其表达在小鼠和人的几种组织中随着衰老而减少,是衰老的生物学标记。五倍子酸(gallic acid,GA)是一种多酚天然产物,广泛分布于不同种类的植物,如水果,蔬菜,香料和茶等。目前已知GA具有多种生物作用,例如,抗炎,抗微生物等。GA对多种癌细胞具有抗癌活性,以及具有抗糖尿病和抗氧化等特性。但GA对胸腺萎缩的影响报道不多,GA是否能够延缓胸腺的衰老和促进胸腺再生有待深入探索。本研究主要探索GA是否对胸腺衰老具有保护作用,以及是否通过影响干性因子Sox2和Nanog的表达来延缓胸腺的衰老和促进胸腺再生。干性因子Sox2和Nanog在维持祖细胞的多能性中至关重要。研究报道Sox2和Nanog在mTEC中表达,表明在成体胸腺中存在上皮细胞祖细胞[1]。Sox2和Nanog在成体胸腺中的表达如何,GA是否通过影响干性因子Sox2和Nanog的表达,动员上皮细胞祖细胞,促进胸腺再生,从而对胸腺衰老起到保护作用值得进一步探究。因此,本研究首先检测正常发育的小鼠胸腺Sox2和Nanog的表达位置及变化;其次对6月龄小鼠GA给药6周,检测Sox2和Nanog的表达,探索GA是否通过调控Sox2和Nanog的表达对胸腺的萎缩有保护作用;并建立D-半乳糖(D-galactose,D-gal)急性致衰小鼠模型,检测GA干预后胸腺中Sox2和Nanog的表达,探索GA是否通过Sox2和Nanog对延缓胸腺衰老和促进其再生有作用。由于组织修复通常由干细胞或祖细胞驱动,本研究期望为胸腺再生机制提供重要的理论依据。方法1.实验分组:①不同发育时期昆明小鼠(1M,6 M,9 M,12M)每组5只。②昆明小鼠(6M)共20只随机分为两组,6M+CMC(羧甲基纤维素钠)组为对照组,6M+GA组,GA给药6周。③昆明小鼠(2 M)30只随机分为三组,每组10只:Control组、D-gal组、GA组。D-gal组和GA组腹腔注射给药8周D-gal(120 mg/kg.d)建立小鼠急性衰老模型,从第3周开始,GA组五倍子酸(250 mg/kg/day)灌胃给药6周。以上动物,取材前一个月腹腔注射溴脱氧尿嘧啶核苷BrdU(120mg/kg)。麻醉小鼠,取胸腺组织。2.胸腺组织学分析:胸腺组织制备石蜡切片,HE染色观察胸腺形态结构变化,免疫组织化学观察K5(标记mTECs),K8(标记cTECs),BrdU(滞留实验标记胸腺中的干细胞),Sox2和Nanog的表达(n=5)。免疫荧光观察D-gal建立小鼠急性衰老模型后胸腺K5,K8的表达情况。3.胸腺衰老细胞检测:胸腺组织冰冻切片,衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence-associated β-galactosidas,SA-β-Gal)染色观察胸腺中细胞衰老的情况(n=5)。4.胸腺细胞亚群比例分析:胸腺组织研磨,400目网筛分离胸腺细胞,流式细胞术,观察胸腺细胞亚型(CD4+,CD8+)的变化(n=5)。5.胸腺基因表达分析:不同组别胸腺组织分别提取RNA,qRT-PCR检测Sox2和Nanog的mRNA表达水平(n=5)。实验结果1.自然衰老小鼠胸腺中Sox2和Nanog的表达:①随着年龄增长,胸腺体积减小,胸腺指数降低,结构完整性受到破坏,包括皮质和髓质交界处的混乱,脂肪化和衰老细胞增加。②BrdU表达的阳性细胞随着年龄的增长不断减少,主要分布在皮髓质交界和髓质,说明皮髓质交界存在胸腺成体干细胞。③免疫组织化学表明,Sox2和Nanog的表达随着年龄的增长表达呈现下降的趋势,且表达位置主要分布在皮髓质交界处。④qRT-PCR结果表明,Sox2和Nanog的mRNA的表达水平也随着年龄的增长呈现下降的趋势。2.6月龄小鼠GA给药胸腺中Sox2和Nanog的表达:①胸腺体积和胸腺指数都明显高于对照组,给药后,皮质增厚,皮髓质分界明显,衰老细胞与对照组比较明显减少。②BrdU表达的阳性细胞在给药后与对照组小鼠相比明显升高。③免疫组织化学表明,Sox2和Nanog的表达在给药后与对照组小鼠相比明显升高。④qRT-PCR结果表明,Sox2和Nanog的mRNA表达在给药后与对照组小鼠相比明显升高。3.GA对D-gal急性衰老模型小鼠胸腺Sox2和Nanog表达的影响:①Control组和GA组小鼠胸腺体积和胸腺指数都高于D-gal组。D-gal组胸腺组织萎缩,皮髓质分界不清,而Control组和GA组皮髓质交界明显,且皮质也比较厚,胸腺结构比较完整。D-gal组小鼠胸腺衰老细胞较多,给予GA后衰老细胞减少。②流式细胞术显示,D-gal组小鼠表现出T细胞亚型的紊乱,而GA给药后改善了 T细胞亚型紊乱的状况。③BrdU实验发现BrdU 阳性细胞在Control组和GA表达量较高,D-gal组滞留较少且基本检测不到。④免疫组织化学表明,D-gal处理后Sox2和Nanog的表达明显减少,GA给药后,表达量明显增高。⑤qRT-PCR结果表明,D-gal组Sox2和Nanog的mRNA表达明显下降,GA给药后,表达量明显增高。结论1.Sox2,Nanog在小鼠胸腺中呈年龄依赖性改变。五倍子酸可上调小鼠胸腺中Sox2,Nanog 表达。2.小鼠胸腺的皮髓质交界处Sox2,Nanog和BrdU 阳性细胞较多,表明胸腺皮髓质交界处可能存在胸腺成体干细胞/祖细胞龛。3.五倍子酸可能通过增加Sox2和Nanog的表达对胸腺增龄性萎缩和D-半乳糖导致的胸腺损伤有保护作用,促进胸腺的再生。