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空肠弯曲杆菌(Camplylobacter jejuni)是全球范围内引起人和动物食源性腹泻的主要病原菌，有研究发现，C.jejuni的发病机制与鞭毛在宿主上皮细胞的定植力、黏附、侵袭力以及毒素的产生密切相关。本实验室前期研究发现在红霉素诱导的耐药空肠弯曲杆菌中cj0440c出现上调表达;在C.jejuni NCTC11168中，cj0440c基因缺失突变后，该菌的鞭毛出现断裂，且鞭毛相关基因出现差异表达。cj0440c基因对鞭毛的具体调控机制尚不清楚，NCBI上注释该基因为假定转录调节子，但尚未有研究发现其能调节哪些基因的表达。有研究表明，Cj0440c的同源蛋白TenA（两者同源性为30.7％）为一个硫胺素酶，能参与到硫胺素的合成代谢，猜测Cj0440c也可能具有硫胺素酶的作用。 为了研究cj0440c基因的功能，本研究通过观察在不同药物处理下菌株中cj0440c与鞭毛相关基因的表达量，分析cj0440c与各鞭毛基因之间的关系;在大肠杆菌里重组表达Cj0440c蛋白，通过酶解实验验证Cj0440c蛋白是否参与硫胺素的代谢途径;构建空肠弯曲杆菌过表达载体，尝试利用染色质免疫共沉淀的方法体内筛选Cj0440c直接调控的目的基因;通过凝胶阻滞实验体外验证Cj0440c蛋白与前期基因芯片结果中cj0440c缺失突变后差异表达的九个鞭毛相关基因之间的相互作用。 测定弯曲杆菌对九种药物（红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、庆大霉素、依替米星、四环素、替加环素、恩诺沙星、加替沙星）的MIC以及MPC，确定各种药物的选择突变窗(MSW)，筛选出1/2MPC药物浓度的耐药菌，分析cj0440c以及鞭毛相关基因的表达量。结果显示，在NCTC11168的耐药菌株中，除了替加环素耐药菌中cj0440c下调表达外，其他药物的耐药菌中cj0440c均上调表达。在红霉素诱导的耐药菌中cj0440c上调表达，cj1338c也上调表达，与前期研究中，红霉素耐药菌株cj0440c缺失突变后，cj1338c下调表达结果相符。在所选的两种氨基糖苷类药物以及两种四环素类药物的耐药菌中，其他四个基因的表达趋势与cj0440c一致。而在所选的两种氟喹诺酮类药物中，cj0440c上调表达，cj1338c和cj1339c均下调表达，cj0043和cj0697均上调表达。在ATCC33559的耐药菌株中，除了在红霉素、阿奇霉素、庆大霉素这三种药物的耐药菌中cj0440c上调表达，在其他药物的耐药菌中均下调表达。在红霉素和庆大霉素的耐药菌中cj0440c以及其他的鞭毛基因均上调表达。当cj0440c出现下调表达时，这四个鞭毛基因中至少会有一个基因出现下调表达。反向证明cj0440c能够引起鞭毛相关基因的差异表达。 利用pET28a构建含有cj0440c基因的原核表达重组载体P-440，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，采用抗His标签的抗体通过Western-blot来验证表达的融合蛋白，并通过Ni-NTA亲和层析得到纯化的Cj0440c。以硫胺素为底物，通过观察Cj0440c能否催化硫胺素的降解产生4-甲基-5-羟乙基噻唑和4-氨基-5-羟基甲基-2-甲基嘧啶来验证该蛋白是否具有硫胺素酶的功能。结果表明，反应后的体系中并未发现硫胺素的分解产物。 利用大肠杆菌DH5α-空肠弯曲杆菌穿梭载体pRY112构建含有cj0440c的表达载体，用于在C.jejuni中进行染色质免疫共沉淀从体内筛选Cj0440c的调控基因。过表达载体构建成功后，尝试自然转化、电转化以及接合转移的方式将载体转入到空肠弯曲杆菌中，但均未成功，最终改为体外的方式验证Cj0440c对目的基因的调控作用。 根据实验室前期研究，挑选出cj0440c缺失突变菌株中九个差异表达的基因(cj1026c(假定脂蛋白)、cj1729c(鞭毛钩蛋白FlgE)、cj1466(鞭毛钩相关蛋白FlgK)、cj0687c(鞭毛基体L环FlgH)、cj0697(鞭毛基体棒蛋白FlgG2)、cj0698(鞭毛基体棒蛋白FlgG)、cj1632c(假定的周质蛋白)、cj1339c(鞭毛蛋白FlgA)以及cj1462(鞭毛基体P环FlgI))进行凝胶阻滞实验。结果发现Cj0440c蛋白不能直接与上述九个基因的启动子片段相结合。 综上所述，在九种药物诱导的耐药菌株中，cj0440c与各鞭毛相关基因都出现差异表达，且表达量与红霉素耐药菌株中的表达量以及cj0440c缺失突变菌株中差异表达量相符。当cj0440c下调表达时，所选的四个鞭毛相关基因中至少会有一个基因下调表达，间接验证了cj0440c能够参与到鞭毛的合成代谢。本研究成功表达Cj0440c蛋白，硫胺素酶解实验验证该基因并不具有硫胺素酶的作用。凝胶阻滞实验中，Cj0440c蛋白并不能直接与cj1026c、cj1729c、cj1466、cj0687c、cj0697、cj0698、cj1632c、cj1339c以及cj1462这九个基因的启动子区域相结合，推断出可能Cj0440c并不能直接调控这些鞭毛基因的表达。本课题的研究有助于了解cj0440c与空肠弯曲杆菌鞭毛相关基因间的相互作用，对完善空肠弯曲杆菌鞭毛合成调控机制具有参考意义。