禽流感H5N1亚型病毒黄爪隼分离株的基因特征及致病性分析

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黄爪隼(Lesser Kestrel,Falco naumanni)为野生迁徙猛禽,它的活动领域大,范围广,以肉食为主,包括野生鸟类,家禽及小鼠,2007年1月,从活体黄爪隼中分离出一株禽流感病毒,后经国家禽流感参考实验室鉴定,为高致病性禽流感病毒H5N1亚型,同时命名A/Lesser Kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)。这是首次在中国黑龙江省地区的迁徙猛禽中分离出高致病性禽流感H5N1亚型病毒。本论文用SYBR Green I RTPCR方法从肛-咽拭子和鸡胚尿囊液中检测出A/Lesser Kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)病毒,通过设计包括H5N1全基因组阅读框(ORF)的特异性引物(HA,PB2,PB1,PA为分段扩增),成功的克隆了A/Lesser Kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M和NS基因。根据测得的基因序列绘制遗传进化树,发现此分离株起源于2005年后中国南方家禽源H5N1病毒,HA基因的同源率在98.8%~99.2%:NA基因的同源率在95.2%~96.6%之间,由此推断A/LesserKestrel/Harbin/194/2007(H5N1)为禽源分离株感染黄爪隼。分析H5N1基因型A/Lesser Kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)应属于基因Z型,但此分离株的PB2基因却与H5N1基因z型分离株的PB2基因同源率较低(87%~88%),此分离株可能在传播过程中发生了基因重组。A/Lesser Kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)株血凝素蛋白在HA1与HA2的裂解位点区域有多个碱性氨基酸的插入:5′-PLRERRRKR↓GLFG-3′,具有高致病性禽流感病毒H5N1亚型病毒的特征。黄爪隼在被采集肛-咽试子样本3个小时后死亡,为了验证A/Lesser Kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)的致病性,用含有此分离株的鸡胚尿囊液对鸡静脉接种,计算IVPI为2.8;同时感染两组BALB/c鼠,接种剂量为106.0EID50。观察第一组发现小鼠体重明显下降,第八天死亡率达到100%,第二组小鼠在第三天取脏器(脾脏、肺脏、肾脏、脑),均具有病毒滴度,证明A/LesserKestrel/Harbin/194/2007(H5N1)株对小鼠高度致病。
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