哺乳动物孤雌胚胎无法正常发育至出生与印记基因异常表达相关,DNA甲基化在其中发挥重要作用。本研究首先分离培养小鼠孤雌胚胎干细胞系,检测印记基因表达及DNA甲基化;其次利用CRISPR-d Cas9技术构建载体,靶向修饰印记基因H19印记调控区DNA甲基化,研究DNA甲基化对小鼠孤雌胚胎干细胞和孤雌胚胎的影响。1.小鼠孤雌胚胎干细胞（PESCs）的建系及鉴定将SrCl2激活的囊胚期孤雌胚胎置于N2B27培养液中培养,传代后获得孤雌胚胎干细胞系PESCs。检测表明,所获得的PESCs形态与正常小鼠胚胎干细胞（ESCs）相似,81%的细胞具有正常染色体数目（2n=40）;在体外可形成具有三个胚层分化的拟胚体,但在体内未形成畸胎瘤。与ESCs相比,PESCs母系印记基因Igf2表达较低,Snrpn启动子区呈高甲基化状态;父系印记基因H19表达较高,H19启动子区呈低甲基化状态。2.H19基因印记调控区DNA甲基化修饰的作用研究研究表明印记调控区DNA甲基化影响H19/Igf2表达水平,本研究检测表明,该区域4个CTCF结合位点中CTCF4结合位点DNA甲基化在PESCs明显低于ESCs。为探究PESCs中H19基因印记调控区DNA甲基化修饰对Igf2表达的调节,构建了CRISPR/d Cas9-Dnmt3a载体,并针对CTCF4结合位点设计CTCF4-sg RNA;经Bam HI和Xho I双酶切,连接CTCF4-sg RNA至空载体pg RNA-humanized,测序验证sg RNA-humanized载体构建成功。利用慢病毒转染法将载体CRISPR/d Cas9-Dnmt3a与sg RNA-humanized共转染PESCs后,发现CTCF4结合位点DNA甲基化明显增加,Igf2 m RNA表达升高,H19 m RNA表达减少。Ch IP检测表明,转染后CTCF蛋白与H19印记调控区结合减少,而CTCF表达在转染前后无明显差异。为研究H19印记调控区DNA甲基化修饰对胚胎发育的影响,对激活后的孤雌胚胎显微注射靶向修饰载体,移植后解剖观察到畸形胚胎,暂未获得正常出生个体。综上所述,CRISPR/dCas9-Dnmt3a介导的方法可以对H19/Igf2基因座CTCF结合位点进行DNA甲基化修饰,通过调节基因表达对小鼠孤雌胚胎干细胞和孤雌胚胎发育产生影响。本研究为阐明印记基因簇H19/Igf2的调控及深入研究孤雌胚胎发育机制提供了研究基础。