外源性内皮祖细胞在大鼠肝癌模型中的分布及其对肝癌作用的研究

来源 :泸州医学院 西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:beakerzhou
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目的:探索内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)所致大鼠肝癌模型中的分布规律,并进一步探讨其在肝癌形成过程中的作用,为肝癌的治疗提供新的策略。 方法:①分组:将雄性SD大鼠160只,随机分3组:空白对照组(24只)、模型对照组(34只)、EPCs实验组(102只),其中又将EPCs实验组依据注射EPCs浓度不同,分为低、中、高3个浓度组,每组都分成4、6、8周组;空白对照4、6、8周组均为8只/组;模型对照与EPCs低、中、高浓度4周组均为10只/组;模型对照与EPCs低、中、高浓度6、8周组均为12只/组。②造模:取SD大鼠外周血,用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,同时用碱性成纤维细胞生长因子(basicity fibroblast growth factor,bFGF)和内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement,ECGS)诱导,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil—acLDL)和FITC标记的荆豆凝集素—1(FITC—UEA—1)荧光双染色法鉴定EPCs,免疫组化染色法检测EPCs标志物CD34、CD133和KDR的表达,体外经DAPI标记后,并将EPCs—DAPI制成1×106/mL,2×106/mL,4×106/mL的低、中、高浓度悬液,模型对照组和EPCs实验组腹腔注射DEN造模,以0.9%NaCl溶液配置成浓度为40mg/mL(4%)的DEN稀释液,按每次0.1 mL/100g体重的剂量腹腔注射,每周2次,直至8周,空白对照组则腹腔注射与DEN等体积的生理盐水。EPCs实验组自注射DEN的当日开始,经尾静脉注射低、中、高浓度EPCs—DAPI悬液1mL,每周2次,空白对照组和模型对照组经尾静脉注射生理盐水1 mL,分别于第四、六、八周末处死,留取标本。③指标检测:肝功能丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、白蛋白(ALB),肝癌血清学指标甲胎球蛋白(AFP),肝组织病理HE染色,荧光显微镜观察EPCs—DAPI表达的量及分布的变化,并用Imagepro plus图像分析软件对表达的阳性区域面积(Positive area,PA)作半定量分析。④统计学处理:用SPSS14.0统计软件处理,数据用均数士标准差(X±S)表示,计量资料采用单因素方差分析,规定P<0.05为有统计学意义。 结果:1.动物的一般情况:大鼠在给予DEN注射后,均不同程度地出现体毛干枯无泽、活动及食量减少,大便溏泻、小便黄而少等;不同浓度的EPCs实验组随造摸时间的延长,一般情况更差,活动迟缓,体重降低等,尤以EPCs高浓度8周组明显。2.EPCs的鉴定:倒置显微镜下观察收集的外周血单个核细胞,第2天可见少数细胞贴壁,呈梭形,形态较均一,胞核位于细胞中央。培养4天后可见贴壁细胞数量明显增多,而悬浮细胞减少。7天后细胞梭形更为明显,并逐渐变长。贴壁细胞用Dil—acLDL和FITC—UEA—1行荧光化学染色,Dil—acLDL标记阳性细胞呈红色,FITC—UEA—1标记阳性细胞呈绿色,荧光显微镜下双染色阳性细胞为橙黄色.贴壁细胞培养第7天,细胞表面标志物CD34,CD133和KDR免疫细胞化学染色均呈阳性。3.肝组织肉眼及镜下观:3.1肉眼及HE染色:①空白对照组大鼠肝脏外观呈红褐色,质软,表面光滑;镜下肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常。②模型对照和EPCs低浓度4周组大鼠肝脏外观多呈暗黄色,质地较硬,表面呈小结节状,凸凹不平;镜下癌细胞排列呈梁状或多板状排列。③EPCs低浓度6、8周组和EPCs中浓度4周组大鼠肝脏外观呈暗黄绿色,表面见圆形结节大小不一,有的见单个巨大孤立性癌肿;镜下癌细胞呈梁状腺样结构,弥漫性分布。④EPCs中浓度6、8周组和EPCs高浓度4周组介于③和⑤之间。⑤EPCs高浓度6、8周组大鼠肝脏外观呈黄褐色,表面见形状不规则的结节,有的伴有多个巨大癌肿,边缘清楚,可有纤维包膜包绕;镜下癌细胞呈梁状或腺样或硬癌样结构。3.2免疫组化染色:3.2.1免疫组化染色观察:EPCs实验组中DAPI均呈阳性,且依注射EPCs悬液浓度高低和时间长短呈上升趋势,表达逐渐增强,在视野中密集分布,染色渐深。3.2.2免疫组化染色图像的半定量分析:①EPCs低、中、高浓度4周组,EPCs低、中、高浓度6周组和EPCs低、中、高浓度8周组PA值比较:差异具有显著性(P<0.05);②低浓度EPCs4、6、8周组,中浓度EPCs4、6、8周组和高浓度EPCs4、6、8周组PA值比较:差异具有显著性(P<0.05);4.血清学指标的变化:①DEN对肝功的影响:模型对照4周组、低浓度EPCs4周组与空白对照组比较,ALT,AST均显著升高(P<0.05),ALB显著降低(P<0.05)。②EPCs对肝功的影响:EPCs低、中、高浓度4周组,EPCs低、中、高浓度6周组和EPCs低、中、高浓度8周组比较,ALT,AST均显著升高(P<0.05),ALB显著降低(P<0.05)。低浓度EPCs4、6、8周组,中浓度EPCs4、6、8周组和高浓度EPCs4、6、8周组比较,ALT,AST逐渐升高,差异具有显著性(P<0.05),ALB逐渐降低,差异具有显著性(P<0.05)。⑧AFP变化:模型对照4周组、低浓度EPCs4周组与空白对照组比较,明显升高,有显著差异(P<0.05),EPCs低、中、高浓度4周组,EPCs低、中、高浓度6周组和EPCs低、中、高浓度8周组比较,明显升高,有显著差异(P<0.05),低浓度EPCs4、6、8周组,中浓度EPCs4、6、8周组和高浓度EPCs4、6、8周组比较,逐渐升高,差异具有显著性(P<0.05)。 结论:①DEN制作大鼠肝癌模型,具有造模周期短、成功率高、所形成的肝癌模型类似于人类肝癌的发病、损伤机理和病理特点,是研究肝癌发病与防治较理想的模型之一。②EPCs体内示踪在肝组织的分布和表达水平表明其对肝癌有靶向作用。③EPCs对肝癌形成过程有促进作用。④EPCs在肝癌形成过程中对肝功能有影响,且随着造模时间的延长及注射EPCs浓度的升高而加重。⑤EPCs靶向到达肝癌组织的作用机制可能是在肿瘤分泌的VEGF、SDF—1,GM—CSF等多种细胞因子和趋化因子作用下,EPCs从骨髓动员到外周血循环,靶向归巢到癌组织,参与肿瘤血管的生成。
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