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研究背景:肝纤维化是肝损伤持续存在,组织发生修复反应时因细胞外基质(ECM)合成、降解和沉积不平衡而引起的病理过程,是涉及复杂的细胞及分子机制的动态过程。肝纤维化机制的研究已发展到分子生物学水平,但仍未完全阐明。目前已明确,肝星状细胞(HSC)激活并转化为肌成纤维细胞是肝纤维化发生发展的中心环节,而表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是HSC活化的标志。另外,转化生长因子β1(TGFβ1)是目前公认的致纤维化最强有力的细胞因子之一,Smad3是介导TGFβ1诱导肝纤维化作用的关键信号转导分子。Boers等[16]运用基因表达序列分析方法(SAGE)来探测人类和小鼠HSC转化为肌成纤维细胞的过程中整个基因组转录的改变,结果显示胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)mRNA在转化中期的HSC中表达最高。导师刘立新等[17, 18, 19]研究发现肝纤维化患者肝组织中IGFBPrP1的表达较正常对照组明显增强,与TGFβ1的高表达及胶原合成的增多成正相关关系。IGFBPrP1在TGFβ1诱导的活化HSC中表达明显增强,并与CollagenⅠ呈正相关关系;抗IGFBPrP1抗体可逆转TGFβ1诱导的HSC产生的过多的CollagenⅠ。IGFBPrP1可激活HSC且在一定剂量范围内随着IGFBPrP1剂量的增加,HSC活化的程度逐渐增强。为明确IGFBPrP1是否具有促肝纤维化作用,并探讨IGFBPrP1在肝纤维化过程中可能的作用机制,设计了本课题。目的:观察在硫代乙酰胺(TAA)诱导的实验性小鼠肝纤维化形成过程中,肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)、转化生长因子β1(TGFβ1)以及Smad3表达水平的动态变化,探讨IGFBPrP1在肝纤维化发生发展过程中可能的作用及其机制。方法:采用腹腔注射TAA的方法制备小鼠肝纤维化模型,按作用时间将动物随机分为4、5、6周及正常对照组共4组,采用Masson染色检测肝组织胶原沉积,免疫组织化学检测肝组织中IGFBPrP1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、纤维连接蛋白(FN)、TGFβ1和Smad3蛋白表达和分布,同时以Western blot法检测IGFBPrP1、α-SMA和Smad3蛋白表达,并对以上指标进行相关性分析。所有数据均以±s表示,进行ANOVA单因素方差分析,组间差异用SNK-q检验。相关性采用Pearson相关分析,以P<0.05为差异有显著性的界限。结果:1.免疫组织化学染色图像分析结果:模型组肝纤维化小鼠肝组织中IGFBPrP1、α-SMA、CollagenⅠ、FN、TGFβ1和Smad3表达较正常对照组明显增强(1.06±0.05,2.03±0.08,5.03±0.09 vs 0.21±0.03,F=1783.141,P<0.05;3.48±0.12,7.93±0.15,10.09±0.18 vs 0.11±0.04,F=998.200,P<0.05;4.08±0.12,7.99±0.15,11.01±0.16 vs 0.22±0.01,F=886.715,P<0.05;4.00±0.14,10.18±0.15,19.81±1.62 vs 0.31±0.09,F=935.242,P<0.05;2.80±0.15,3.81±0.17,5.97±0.19 vs 0.49±0.02,F=931.241,P<0.05;0.74±0.03,1.24±0.05,2.03±0.07 vs 0.22±0.03,F=697.118,P<0.05)。随着肝纤维化的发展,模型组肝纤维化小鼠肝组织中IGFBPrP1、α-SMA、CollagenⅠ、FN、TGFβ1和Smad3表达逐渐增强,模型组组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.免疫组织化学染色图像分析结果相关分析显示:在肝纤维化形成过程中,IGFBPrP1的表达与α-SMA、CollagenⅠ、FN、TGFβ1和Smad3的表达均呈正相关关系(r=0.906,0.927,0.988,0.947,0.977,P<0.01)。3. Western blot检测结果:模型小鼠肝组织的IGFBPrP1、α-SMA、FN和Smad3蛋白表达量较正常对照组明显升高,经内参照(β-actin)校正后显示(0.41±0.05,0.61±0.05,0.92±0.07 vs 0.23±0.01,F=57.316,P<0.05;0.64±0.03,0.90±0.03,1.39±0.03 vs 0.36±0.02,F=201.214,P<0.05; 0.06±0.02,0.09±0.01,0.12±0.02 vs 0.03±0.01,F=103.871,P<0.05;0.20±0.02,0.31±0.04,0.56±0.04 vs0.09±0.01,F=72.966,P<0.05)。随着肝纤维化的发展,模型组肝纤维化小鼠肝组织中IGFBPrP1、α-SMA、FN和Smad3表达逐渐增强,模型组组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4. Western blot分析结果相关分析显示:在肝纤维化形成过程中,IGFBPrP1的表达与α-SMA、Smad3和FN的表达均呈正相关关系(r=0.982,0.924,0.965,P<0.01)。结论:1. IGFBPrP1随着肝纤维化程度的加重,其表达逐渐上调,推测其具有促肝纤维化的作用。2. IGFBPrP1的促肝纤维化的作用与促进HSC激活、使ECM的重要组成成分Collagen I和FN的合成与分泌增加有关。3. IGFBPrP1的促肝纤维化的作用可能与影响TGFβ1/Smad3信号通路有关。