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依匹乳糖和乳果糖都是非天然存在的寡糖,具有许多出色的生理功能,服用后因无法被人体直接吸收,所以不会升高血糖,与当代健康饮食的观念相符,具有非常大的市场前景。乳糖是一种天然存在于哺乳动物乳汁中的碳水化合物,作为奶酪和酪蛋白工业的副产物,每年产量极大,曾经乳糖被认为没有利用价值而被直接丢弃,造成极大的环境污染问题。纤维二糖2-差向异构酶（CEase）可以将乳糖转化为依匹乳糖和乳果糖,该酶在复杂的牛奶体系中依旧可以稳定发挥其催化功能。本论文利用分子动力学模拟技术对Uniprot数据库中新微生物来源的CEase结构柔性进行分析,获得均方根偏差预测其热稳定性。根据以往报道总结可知,热稳定性越高的CEase,产乳果糖能力越好。热稳定性低的几乎不产乳果糖,但是可以在低温下保持较高的差向异构化活性,产物单一,适合于低温环境下的乳制品工业生产,对于根据工业所需理性选择新来源的CEase具有很大的指导意义。通过计算筛选获得热稳定性较高的Dictyoglomus thermophilum H-6-12来源的CEase（Dith-CE）和热稳定性差但灵活性较高的适合于低温工业应用的Treponema brennaborense DSM 12168来源的CEase（Trbr-CE）。构建表达载体,将其在大肠杆菌表达系统中构建表达,并发酵培养并纯化获得纯酶进行酶学性质鉴定。Dith-CE差向异构化最适温度为75℃,异构化最适温度为85℃,最适pH为7.0,在E.coli中差向异构化发酵酶活为11.9±0.8 U mL-1。在75℃条件下,其保温12 h后仍可保留75%的残余酶活。以乳糖为唯一底物时,Dith-CE催化差向异构化反应的比酶活为160±6.5 U mg-1,动力学参数kcat值为441.4±15.4 s-1,Km值为523.2±9.98 mmol L-1,异构化比酶活为3.52±0.23 U mg-1,kcat值为3.98±0.3 s-1,Km值为235.2±11.2 mmol L-1。Trbr-CE催化差向异构化反应最适温度为45℃,最适pH为7.0,以乳糖为唯一底物时,差向异构化发酵酶活为13.7±0.6 U m L-1,纯酶的比酶活为208.5±5.3 U mg-1,kcat值为135.1±5.5 s-1,Km值为57.8±1.94 mmol L-1。枯草芽孢杆菌属于非致病性微生物,是食品安全级的工业生产微生物。为推进CEase在食品工业中的发展,本论文将Dith-CE进行食品级表达。将目的基因插入到以D-丙氨酸消旋酶基因代替抗生素基因的pUB110载体中,转入到D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 1A751）中进行异源表达,经24 h后其差向异构化发酵酶活最高可超过6 U mL-1。采用营养缺陷型代替抗生素进行筛选,避免了抗生素的使用对人体造成的伤害和对环境的污染。