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目前,在各种肿瘤中,肝癌的发病率位居世界第5位,是肿瘤死亡病因的第3位,在我国也高居不下。肝癌细胞对于传统化疗药的高抵抗性,以及肝癌的转移、复发,使得大部分肝癌病人的预后前景不良。其中,肝癌干细胞的存在被认为与肝癌的抗药性,转移及复发有着密切的关系。目前,对于肝癌的靶向治疗药物多是一些配体、膜表面受体和受体耦连的激酶的小分子抑制剂,这些分子在参与肝癌发生发展的信号传导途径中发挥了重要作用。但对于肝癌干细胞的治疗却不多见,鉴于肝癌干细胞在肝癌发生发展中的重要作用,对于肝癌干细胞的靶向治疗需求迫切。本实验室前期用成集落生长的人肝癌细胞球免疫了小鼠,制备、筛选、获得了与肝癌干细胞标志物CD133共染获得特异性识别肝癌干细胞的单抗34株。在本研究中,为了获得识别多种类型肝癌干细胞的单抗,我们进一步选用肝癌细胞系MHCC97H细胞作为模型,以该细胞系的干细胞标志物CD90为标志,采用活细胞流式荧光术检测了单抗与CD90在MHCC97H亲本细胞和sphere细胞中的共染,利用无血清悬浮培养即sphere培养可以富集肿瘤干细胞的特性,筛选出能在sphere细胞中富集,且与CD90共染富集的单抗18株。接着,我们又选择了以ESA为干细胞标志物的Be17402-V3细胞对上述18株单抗进行了复筛,采用与上述同样的方法,筛选出能在Be17402-V3sphere细胞中富集,且能与ESA共染富集的单抗15株。从中,我们选择了单抗15B7在Be17402-V3细胞中进行了深入研究。活细胞与固定细胞免疫荧光的检测发现,单抗15B7识别的靶抗原在细胞膜和细胞浆中都有分布,胞浆中的抗原表达高于胞膜；活细胞流式检测发现,单抗15B7约识别2.7%-3.0%的Be17402-V3细胞,其所识别的阳性细胞在Be17402-V3sphere中富集了2.2倍,其能识别24%的ESA+干细胞；分选15B7识别阳性的细胞进行相关体能外肿瘤干细胞特征研究,结果15B7+的细胞也显现出比15B7-和亲本细胞更强的成球能力、侵袭能力和耐药性,并且15B7+细胞的裸鼠致瘤能力较亲本细胞强10倍,证明了单抗15B7是可以识别肝癌干细胞的单抗。进一步,我们用纯化的15B7单抗进行了一系列体内外抑制肝癌干细胞或肝癌移植瘤的实验研究。成球抑制实验显示,单抗15B7孵育组的成球数量(91.7±17.0)明显低于阴性对照组的成球数量(135.7±12.7),对Be17402-V3细胞的成球抑制率达32.4%(P<0.05)；侵袭抑制实验显示,单抗15B7孵育组的侵袭细胞数也明显低于阴性对照组,对Be17402-V3细胞侵袭的抑制率达30.7%(P<0.05)；但在增殖抑制实验中,单抗15B7并没有显示出明显的对Be17402-V3亲本细胞的增殖抑制；耐药性的增敏实验显示,经单抗15B7处理后的Be17402-V3细胞对顺铂的IC50值为0.14μg/ml,比对照组细胞对顺铂的IC50值(0.27μg/ml)明显降低。以上结果证明,经单抗15B7可明显抑制肝癌细胞Be17402-V3的多种肿瘤干细胞感性相关特性,如自我更新能力、侵袭能力和耐药能力。裸鼠体内的抗体治疗实验显示,单抗15B7单独应用时可抑制肝癌移植瘤的生长,低、中、高剂量对移植瘤体积的抑制率分别达8.4%,53.1%和67.4%,且存在量效关系；当与化疗药物联合应用时,显示出最大的抑制率,达87.2%,疗效好于单独化疗组和单独抗体组,显示出化疗药物与单抗联合的优势。采用免疫组化的方法研究了单抗15B7识别临床肝癌患者组织的情况,分析发现单抗15B7的靶抗原在84.5%人肝癌组织中特异性达,而在癌旁正常肝、肝炎、肝硬化等非癌组织中均没有表达。亲和分离单抗15B7的靶抗原,经质谱鉴定其靶抗原为蛋白A,文献已报道A蛋白与其他一些肿瘤的预后密切相关,但在肝癌中鲜见有该蛋白的报道。利用免疫荧光激光共聚焦观察发现,A蛋白的商业化抗体显示的A蛋白可与15B7靶抗原单抗共定位：WB结果显示,经原核表达的、纯化后的A蛋白可被单抗15B7识别；免疫共沉淀的结果也显示,经单抗15B7和A蛋白的商业化抗体沉淀的蛋白均可被对方所识别；这些实验初步证明了A蛋白确是单抗15B7的靶抗原。进一步的研究工作正在进行中。鉴于单种抗体所识别的肿瘤干细胞可能不完整,导致其对于肿瘤的疗效受限,我们探索了联合具有不同肿瘤干细胞靶点的多个单抗对肿瘤细胞的抑制作用。采用单抗9A9与15D2联合进行实验,流式荧光结果显示,在Be17402-V3亲本和sphere细胞中,联合单抗与干细胞标志物ESA共染比例略大于2种单抗分别与标志物ESA共染比例的和,提示它们识别不同的肿瘤干细胞；单抗9A9与15D2联合各300μg/ml时,对Be17402-V3的成球抑制率和侵袭抑制率均明显高于300μh/ml和600μg/ml浓度的单种单抗对Be17402-V3的功能抑制；经联合单抗处理过的细胞耐药能力也较经等浓度单个单抗处理过的Be17402-V3细胞耐药能力显著降低(9A9+15D2：IC50为0.32μg/ml；9A9:IC50为0.58μg/ml；15D2:IC50为0.56μg/ml)；以上实验结果提示了联合单抗对肝癌细胞的功能抑制作用要强于单种单抗的抑制作用。同样,我们在一株肺癌细胞系SPCA-1中,也成功验证了联合单抗对肺癌细胞的抑制作用优于等浓度单种单抗的抑制作用。证明了在不同癌种中,均可以进行多靶点联合治疗的尝试。综上所述,本研究筛选出了同时识别肝癌CD90+和ESA+肝癌干细胞亚群的单抗15株,其中单抗15B7不仅可以识别肝癌干细胞,还具有抑制肝癌干细胞侵袭、成球和耐药的能力,且有明显的体内抑制人肝癌移植瘤生长的功能,且可增强化疗疗效；鉴定单抗15B7的靶抗原为A蛋白,并进行了初步的验证,这些研究为靶向肝癌干细胞的治疗提供了新的候选治疗靶点和治疗性单抗；本研究还发现联合多靶点的抗体治疗能显著提高疗效,有效抑制肿瘤干细胞的各种体外干性相关功能,降低对化疗药物的耐药性,这提供了一种更为有效的肿瘤干细胞靶向治疗的新策略。