绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis, PMO)是以绝经后骨量减少、骨微结构受损,导致骨脆性增加为特征的骨代谢性疾病。成骨细胞(osteoblast, OB)骨形成与破骨细胞(osteoclast, OC)骨吸收间的动态平衡构成了骨重建过程。在相应诱导因素作用下,间充质干细胞可分别向成骨细胞或脂肪细胞分化。自然绝经或去势手术后女性由于性激素缺乏导致骨丢失增加,绝经后骨质疏松症发生率高于同龄男性。PMO主要与性激素紊乱及免疫功能失调密切关联。迄今为止,治疗PMO的方法主要是预防骨吸收；绝经后女性普遍应用的雌激素替代疗法也主要作用于骨吸收,但对成骨细胞分化及其生物学功能调控的研究报道甚少。脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone, DHEA)是体内最丰富的肾上腺来源的甾体激素前体,其生物学功能并不能完全归结于其代谢产物。近来研究发现,绝经后女性DHEA水平低于正常人群,并主张应用DHEA防治PMO。但DHEA对骨代谢作用的生化和分子机制尚未阐明。本研究拟通过如下体内外实验,以解析间充质干细胞向成骨细胞分化的分子机制,免疫细胞对间充质干细胞向成骨细胞分化的调节作用,以及DHEA及补肾宁心中药复方促进间充质干细胞向成骨细胞分化的机制,以评价DHEA或补肾宁心方在防治PMO中的作用机制。第一部分间充质干细胞向成骨细胞分化的分子机制目的探讨小鼠骨髓来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的分子机制方法体外分离培养并鉴定小鼠骨髓来源的间充质干细胞,应用成骨诱导培养液处理；PCR检测成骨细胞特征性的转录因子Runx2, Osterix,Osteocalcein及特征性分子collagen1表达；ALP染色鉴定成骨细胞,及细胞碱性磷酸酶活性比色法定量检测ALP活性；Alizarin Red染色检测骨矿化结节的形成。分析研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1), PI3K抑制剂(LY294002)及mTOR途径阻断剂(Rapamycin)对间充质干细胞向成骨细胞分化的调节作用。体外分离培养小鼠间充质干细胞,以成脂诱导条件处理后,PCR检测脂肪细胞特征性转录因子PPARγ表达,Oil Red O染色计数脂肪细胞,并分别给予IGF-1, PI3K抑制剂及mTOR途径阻断剂,观察其对间充质干细胞向脂肪细胞分化的调节作用。结果在成骨诱导条件下,成骨细胞特征性的转录因子Runx2, Osterix, Osteocalcein及特征性分子collagen1表达增加；间充质干细胞向成骨细胞分化；随着培养时间的延长,形成骨矿化结节。IGF-1促进成骨细胞生成；P13K抑制剂及mTOR途径阻断可阻断IGF-1的作用。在成脂诱导液作用下,脂肪细胞特征性转录因子PPARγ表达增加,可形成成熟的脂肪细胞。IGF-1不影响脂肪细胞生成,P13K抑制剂及阻断mTOR途径可增加脂肪细胞的生成。结论在成骨环境下间充质干细胞可优势表达成骨细胞特征性的转录因子Runx2, Osterix, Osteocalcein及特征性分子collagen1;从而分化为成骨细胞,IGF-1可通过PI3K-mTOR途径促进成骨细胞的分化。第二部分免疫细胞对间充质干细胞向成骨细胞分化的调节作用目的研究骨髓单核细胞及调节性T细胞对间充质干细胞向成骨细胞分化的调控作用。方法体外分离培养小鼠骨髓来源的间充质干细胞,体外分离培养小鼠骨髓单核细胞,将骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养,给予成骨细胞诱导条件处理,PCR检测成骨细胞特征性的转录因子Runx2, Osterix, Osteocalcein表达及特征性分子collagen1, RANKL, OPG表达；ALP染色鉴定成骨细胞并定量检测ALP活性；Alizarin Red染色检测骨矿化结节的形成。将骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养后,给予成脂细胞诱导条件处理,PCR检测脂肪细胞特征性转录因子PPARγ表达,Oil Red O染色计数脂肪细胞。体外分离培养小鼠脾脏Treg,将Treg与间充质干细胞共培养,给予成骨细胞诱导条件处理,定量检测ALP活性；Alizarin Red染色检测骨矿化结节的形成。分别以中和抗体阻断Treg特征性细胞因子IL-10,TGFβ, CTLA-4或Transwell阻断细胞间直接接触,以解析Treg调节OB生成的分子基础。将Treg与间充质干细胞共培养,给予成脂细胞诱导液处理,PCR检测脂肪细胞特征性转录因子PPAR γ表达,Oil Red O染色计数脂肪细胞,观察Treg对间充质干细胞向脂肪细胞分化的调节作用。结果在成骨诱导环境下,骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养抑制成骨细胞生成,结果显示骨髓单核细胞增加间充质干细胞RANKL/OPG表达；下调Osterix、Collagen1mRNA表达；不影响Runx2与osteocalcin表达；成骨细胞ALP活性下降；骨矿结节形成的数目显著减少。在成脂诱导环境下,骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养不影响PPARγmRNA表达；对脂肪细胞的生成无显著影响。Treg可促进间充质干细胞向OB分化,形成的成骨细胞ALP活性增强,骨矿结节数目增加。IL-10, TGFβ, CTLA-4中和抗体或Transwell阻断细胞间直接接触,均部分抑制Treg对OB生成的促进效应。Treg不影响间充质干细胞向脂肪细胞的分化。结论骨髓单核细胞可下调间充质干细胞Osterix、Collagen1mRNA表达,从而抑制间充质干细胞向成骨细胞分化,并使生成的成骨细胞ALP活性下降；骨矿结节形成数目显著减少。Treg可经细胞间直接接触或通过其可溶性细胞因子IL-10,TGFβ,及CTLA-4促进间充质干细胞向OB分化,形成的成骨细胞ALP活性增强,骨矿结节数目增加。但骨髓单核细胞及Treg均不影响间充质干细胞表达PPARγmRNA;对脂肪细胞的生成无调控作用。第三部分DHEA促进间充质干细胞向成骨细胞分化的分子机制目的观察DHEA对间充质干细胞向成骨细胞分化的调控机制。方法在成骨培养条件下,分别将DHEA加入间充质干细胞单培养,骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系,Treg与间充质干细胞共培养体系,骨髓单核细胞-问充质干细胞-Treg三者共培养体系中,PCR检测成骨细胞特征性的转录因子Runx2, Osterix, Osteocalcein表达及特征性分子collagen1, RANKL表达；定量检测ALP活性；Alizarin Red染色检测骨矿化结节的形成。并分别给予IGF-1, PI3K抑制剂及mTOR途径的阻断剂观察其对DHEA效应的影响。在成脂培养条件下,分别将DHEA加入间充质干细胞,骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系中,PCR检测脂肪细胞特征性转录因子PPARγ表达,Oil Red O染色计数脂肪细胞。小鼠去势后灌服DHEA, microCT及骨组织化学染色法检测DHEA对去势小鼠骨形态的调控。流式细胞数检测DHEA对鼠脾脏各淋巴细胞亚群(CD19+B细胞、CD14+单核细胞、CD8+T细胞、CD3e-panNK+细胞、FoxP3+Treg细胞)的调控。结果DHEA促进间充质干细胞向成骨细胞分化；在骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系中,DHEA可下调骨髓单核细胞对成骨细胞生成的抑制作用；在Treg与间充质干细胞共培养体系中,DHEA增强Treg对间充质干细胞向成骨细胞分化的促进作用；在骨髓单核细胞-间充质干细胞-Treg共培养体系中,DHEA也促进了间充质干细胞向成骨细胞的分化；DHEA可促进Runx2、 Collagen1、Osteocalci、OSX表达增强,下调RANKL表达；并使生成的成骨细胞ALP活性增加；骨矿结节形成的数目显著增多。IGF-1、PI3K抑制剂及mTOR途径的阻断不影响DHEA效应。在成脂环境中,不管是在间充质干细胞单培养,还是骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系中,DHEA都促进了间充质干细胞向脂肪细胞分化；PPARy mRNA表达增加。在同样间充质干细胞数目条件下,DHEA分别在成骨环境中或成脂环境中,促进生成的成骨细胞数目和脂肪细胞数目的比值是增加的,因此DHEA的成骨作用占主导地位。体内实验结果表明,DHEA显著改善了骨形态。DHEA下调了去势小鼠脾脏CD19+B细胞、CD14+单核细胞、CD8+T细胞比率；DHEA不改变CD3e-panNK+细胞百分比；DHEA促进了FoxP3+Treg百分比。结论DHEA可直接促进间充质干细胞向成骨细胞分化；DHEA还可下调骨髓单核细胞对成骨细胞生成的抑制作用；DHEA增强Treg对间充质干细胞向成骨细胞分化的促进作用；使Runx2、Collagen1、Osteocalci、OSX表达增强,下调RANKL表达；成骨细胞ALP活性增加；骨矿结节数目显著增多。IGF-1并不能加强DHEA的效应,DHEA的作用途径是非PI3K-mTOR依赖。虽然DHEA也可促进间充质干细胞向脂肪细胞分化,但DHEA的成骨作用占主导地位。DHEA显著改善骨形态；并促进FoxP3+Treg百分比。DHEA可显著改善骨免疫内环境。因此,DHEA可能是一种较为理想的PMO防治方案。第四部分BSNXD促进间充质干细胞向成骨细胞分化的分子机制目的观察BSNXD对间充质干细胞向成骨细胞分化的调控机制。方法在成骨培养条件下,分别将BSNXD中药血清和对照鼠血清加入间充质干细胞单独培养,骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系,Treg与间充质干细胞共培养体系,骨髓单核细胞-间充质干细胞-Treg三者共培养体系中,PCR检测成骨细胞特征性的转录因子Runx2, Osterix, Osteocalcein表达及特征性分子collagen1, RANKL表达；定量检测ALP活性；Alizarin Red染色检测骨矿化结节的形成。并分别给予IGF-1, PI3K抑制剂及mTOR途径阻断剂,观察其对BSNXD中药血清效应的影响。在成脂培养环境下,分别将BSNXD中药血清加入间充质干细胞,骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系中,PCR检测脂肪细胞特征性转录因子PPARγ表达,Oil Red O染色计数脂肪细胞。小鼠去势后灌服BSNXD,microCT及骨组织化学染色法检测BSNXD对去势小鼠骨形态的调控。流式细胞数检测BSNXD对鼠脾脏各淋巴细胞亚群(CD19+B细胞、CD14+单核细胞、CD8+T细胞、CD3e-panNK+细胞、FoxP3+Treg细胞)的调控。结果BSNXD促进间充质干细胞向成骨细胞分化；在骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系中,BSNXD可下调骨髓单核细胞对成骨细胞生成的抑制作用；在Treg与间充质干细胞共培养体系中,BSNXD增强Treg对间充质干细胞向成骨细胞分化的促进作用；在骨髓单核细胞-间充质干细胞-Treg共培养体系中,BSNXD也促进了间充质干细胞向成骨细胞的分化；BSNXD可促进Runx2、Collagen1、Osteocalcin、OSX表达增强,下调RANKL表达；并使生成的成骨细胞ALP活性增加；骨矿结节形成的数目显著增多。IGF-1通过PI3K及mTOR信号途径调控BSNXD效应。在成脂环境中,不管是在间充质干细胞单培养,还是骨髓单核细胞与间充质干细胞共培养体系中,BSNXD都不影响间充质干细胞向脂肪细胞分化；PPARy mRNA表达明显无差异。体内实验结果表明,BSNXD显著改善了骨形态。BSNXD下调了去势小鼠脾脏CD19+B细胞、CD14+单核细胞、CD8+T细胞比率; BSNXD促进了CTLA-4+Treg百分比。与DHEA相比,BSNXD增加骨骼BMD更显著。结论BSNXD可直接促进间充质干细胞向成骨细胞分化；BSNXD还可下调骨髓单核细胞对成骨细胞生成的抑制作用；BSNXD增强Treg对间充质干细胞向成骨细胞分化的促进作用；使Runx2、Collagen1、Osteocalcin、OSX表达增强,下调RANKL表达；成骨细胞ALP活性增加；骨矿结节数目显著增多。IGF-1加强BSNXD的效应,BSNXD的作用途径是PI3K-mTOR依赖。BSNXD显著改善骨形态；并增加CTLA-4+Treg百分比。BSNXD可显著改善骨免疫内环境。与DHEA相比,体内外实验证实BSNXD具有更好的成骨作用。因此,BSNXD可能是一种更为理想的PMO防治方案。