核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种死体营养型植物病原性真菌。核盘菌可以侵染600多种植物,它所引起的菌核病分布范围广且危害严重,造成巨大的经济损失。核盘菌菌核是一种富含黑色素的休眠体,能够在自然环境中长时存活多年,并成为菌核病主要侵染源。FKH是forkhead家族转录因子,作为真核生物中具有多种生物学功能的转录因子。目前,对FKH蛋白在植物病原真菌中作用报道较少。Ss Fkh1是核盘菌中编码forkhead蛋白的转录因子。前期研究发现,Ss Fkh1正调控菌核形成。故此,为揭示核盘菌菌核形成机制,探索Ss Fkh1对核盘菌菌核形成调控途径与调控网络研究具有重要科学意义与应用价值。并取得如下重要研究结果。1.Ss Fkh1参与细胞壁完整性通路调控菌核发育与致病性。与野生型和回补突变体相比,Ss Fkh1基因敲除突变体（ΔSsfkh1）菌核数量减少,干重下降,侵染垫数量减少,致病力减弱。且ΔSsfkh1对高浓度H2O2、渗透胁迫Na Cl和KCl、细胞壁刺激更为敏感。这些结果表明Ss Fkh1的缺失影响核盘菌的生长发育及致病性。此外,ΔSsfkh1菌株中细胞壁完整性被破坏,预示着Ss Fkh1可能参与到细胞壁完整性通路。2.Ss Fkh1的差异表达分析。为进一步探究转录因子SsFkh1调控核盘菌菌核及侵染垫的发育机制,将ΔSsfkh1与野生型菌株不同发育阶段的菌丝进行了转录组测序分析。GO与KEGG富集分析发现大量与细胞壁相关组分与MAPK通路富集。在差异基因代谢通路分析中发现MAPK激酶介导的细胞壁完整性通路。该通路主要由四个关键蛋白激酶组成,分别为PKC1、BCK1、MKK1及SLT2（SMK3）。Ss Fkh1与该通路的四个蛋白互作分析时发现,Ss Fkh1与Ss Mkk1发生相互作用。基于以上研究结果,考虑到SsFkh1敲除突变体对细胞壁刺激及氧化应激表现出极度敏感,以此为切入点研究Ss Fkh1与MAPK通路的联系,进一步探索MAPK级联的相关基因,尤其是保守的细胞壁完整性通路相关基因在核盘菌中的功能。3.核盘菌CWIPs相关基因敲除后影响突变体菌丝生长及菌核发育。除Ss Mkk1敲除突变体（ΔSsmkk1）菌丝生长速率变慢外,其它敲除突变体菌丝生长速率较野生型相比均无明显差异。有趣的是,ΔSsmkk1菌株在生长三周后仍未铺满整个PDA,但菌丝体变多,变厚。镜下观察发现ΔSsmkk1与ΔSssmk3菌株的菌丝生长弯曲。此外,较野生型相比,ΔSsmkk1菌株的菌丝尖端中几丁质分布不均匀,表明Ss Mkk1基因的敲除,影响了突变体中菌丝尖端几丁质的分布,突变体菌丝中几丁质含量减少可能导致ΔSsmkk1菌株菌丝生长缓慢。此外,CWIPs相关基因敲除突变体菌株较野生型菌株产生更少的黑色素,在CWIPs相关基因敲除突变体菌株中黑色素形成相关基因的表达量降低,尤其是在ΔSsmkk1菌株中,黑色素减少明显。表型观察发现,ΔSsmkk1菌株不产生菌核,ΔSspkc1、ΔSsbck1和ΔSssmk3菌株产生的菌核相对于野生型来说数量较少。此外,ΔSsbck1菌株产生的菌核数量较少,但菌核大小要比其回补突变体稍大,但总体质量比野生型与回补突变体菌株轻。4.CWIPs相关基因敲除导致侵染垫发育迟缓。侵染垫观察中发现,较野生型与回补突变体相比,ΔSsmkk1、ΔSspkc1、ΔSsbck1和ΔSssmk3菌株侵染垫发育较为缓慢,并没有形成成熟的侵染垫,且侵染垫数量明显减少。尤其是ΔSsmkk1菌株的菌丝尖端没有形成能有效侵染植物的侵染结构。在ΔSsmkk1菌株中与侵染垫形成相关基因表达量明显下降。说明Ss Mkk1基因的敲除使核盘菌丧失了形成侵染垫的能力,基因Ss Pkc1、Ss Bck1和Ss Smk3的敲除导致侵染垫发育迟缓。5.CWIPs相关基因敲除减弱了核盘菌的毒力。致病力实验中,ΔSsmkk1菌株不能侵染未刺伤的番茄叶片,而能侵染刺伤的番茄叶片,说明Ss Mkk1的毒力主要受侵染垫影响。敲除基因Ss Mkk1后,几乎不产生侵染结构,因此菌丝无法穿透番茄叶面的表皮,从而使毒力降低。ΔSsbck1,ΔSssmk3,ΔSspkc1菌株均能侵染刺伤及未刺伤的番茄叶片,但病斑面积要比野生型较小,这也与敲除突变体侵染垫产生较少有关。此外,CWIPs相关基因敲除突变体菌株表现出不同程度的草酸含量减少且与草酸合成相关基因的表达量明显下降。这些结果表明,一方面Ss Pkc1、Ss Bck1、Ss Mkk1和Ss Smk3基因的侵染结构的减少使核盘菌的毒力降低,另一方面核盘菌重要的毒力因子草酸含量的降低也减弱了核盘菌的毒力。6.CWIPs相关基因敲除突变体对氧胁迫及细胞壁刺激敏感。ΔSsmkk1、ΔSspkc1、ΔSsbck1和ΔSssmk3菌株对氧胁迫、渗透胁迫及细胞壁刺激都为较为敏感。其中Ss Mkk1敲除突变体对H2O2最为敏感。ΔSspkc1与ΔSssmk3对钙氟白更为敏感,而ΔSsbck1对刚果红更为敏感。这些结果表明CWIPs相关基因敲除突变体的细胞壁遭到破坏。综上所述,核盘菌转录因子SsFkh1参与到细胞壁完整性通路中调控核盘菌生长发育与致病性。Ss Fkh1蛋白互作分析及其差异基因表达分析表明Ss Fkh1与MAPK激酶介导的细胞壁完整性通路相关。对核盘菌中MAPK激酶介导的细胞壁完整性通路中关键的蛋白激酶功能分析发现,该通路中CWIPs相关基因敲除突变体表型与转录因子Ss Fkh1敲除突变体的表型高度一致。据此推测转录因子Ss Fkh1协同MAPK激酶介导的细胞壁完整性通路调控核盘菌的生长发育及致病性。目前在核盘菌中对MAPK激酶介导的细胞壁完整性通路调控生长发育及致病性的研究尚未有过报道且对转录因子Ss Fkh1的研究甚少,本研究在一定程度上解析了核盘菌转录因子Ss Fkh1在菌核形成调控途径与调控网络中的作用,这为核盘菌中靶向forkhead蛋白调控途径的药物提供重要理论基础,对防治核盘菌菌核病具有重要的科学意义与经济价值。