胰腺癌是一种缺乏早期临床症状，通常诊断时病情已处于晚期，且具有高致死率的恶性肿瘤。全球每年估计有227000人死于胰腺癌，目前胰腺癌的发病率较以往10年有缓慢升高的趋势[1]。在所有常见恶性肿瘤中，胰腺癌的生存率最低，其1年和5年生存率分别是25%和5%[2]。早期诊断缺乏敏感检测指标、疾病早期已存在远处转移、疾病晚期缺乏有效的治疗方法，以上原因导致胰腺癌患者预后较差[1]。因此寻求早期诊断的预警因子、探寻行之有效的治疗方法，成为目前针对胰腺癌进展研究的热点及焦点。神经浸润（Perineural invasion,PNI）是癌细胞侵及周围神经的过程，也是肿瘤进展转移扩散至周围组织或脏器的一个主要途径，还是疼痛产生的途径之一，在多种恶性肿瘤中作为一个重要的预后因素。PNI同样是胰腺癌已确立的判断预后的条件之一[3]。胰腺癌PNI发生的主要途径是肿瘤侵袭其周围的胰腺内神经，及癌细胞沿着胰腺外神经转移，PNI作为胰腺癌的主要特征之一，预示着肿瘤侵犯行为的产生、肿瘤的进展及胰腺癌患者的预后不良[4]。因此，为了提高胰腺癌的早期检出率及改善预后，目前针对胰腺癌PNI的机制研究日益增多，但具体机制仍待进一步完善。甲状腺激素受体相互作用蛋白6（thyroid hormone receptor interactor6，TRIP6）是zyxin家族成员之一，作为一种调节蛋白和局部粘附分子，与多种分子相关，具有可调节细胞迁移、侵袭、抗凋亡信号传导和转录调控等多个功能[5]，在胶质母细胞瘤、鼻咽癌、尤因氏肉瘤等多种肿瘤中均可检测到TRIP6的表达，TRIP6与肿瘤的发生及进展有关，但其具体机制仍不明确。因此，我们设想TRIP6是否在胰腺癌的进展中占有一席之地，是否与神经浸润有关，是否能作为胰腺癌早期诊断的预警因子，干扰其表达能否作为胰腺癌基因治疗的靶点。本课题拟初步明确不同人胰腺癌细胞株中是否可检测到TRIP6的相关表达，经体外实验明确有TRIP6表达后，建立有效的神经浸润动物模型，观察TRIP6在体内的表达情况，并进一步探讨TRIP6在促进胰腺癌进展、PNI发病中的作用机制。一、TRIP6在不同人胰腺癌细胞株中的表达目的：拟测定TRIP6在不同人胰腺癌细胞株中的基因及蛋白水平，细胞株选择神经浸润能力强的Capan-2细胞株及神经浸润能力低的Panc-1细胞株，另设立SW1990细胞株为对照，观察TRIP6在神经浸润能力不同的人胰腺癌细胞株中表达的差异，在体外水平初步探讨TRIP6与胰腺癌细胞神经浸润能力的相关性。方法：运用分子生物学技术，从mRNA及蛋白不同水平，检测TRIP6在Capan-2、Panc-1及SW1990三株不同的人胰腺癌细胞株中的表达水平，分析表达差异与不同细胞株特点之间的关系，筛选高表达的细胞株备后续实验用。结果：1、TRIP6在3株不同人胰腺癌细胞株中均有不同程度表达。2、不同细胞株中TRIP6mRNA的表达水平有所差异，Capan-2细胞株中TRIP6mRNA的表达显著高于其他两株细胞（P<0.05），细胞株SW1990、Panc-1中TRIP6mRNA的表达量很低。3、不同细胞株中TRIP6蛋白的表达水平有所差异，以Capan-2表达最为显著，其他两株细胞中未见明显TRIP6相关蛋白表达。结论：TRIP6在胰腺癌细胞株中有表达，但在具有不同特点的人胰腺癌细胞株中存在表达差异，以神经浸润能力强的Capan-2细胞株中表达最为显著，初步考虑TRIP6与胰腺癌及PNI可能相关，其在体内的表达情况及具体机制仍待进一步研究。二、胰腺癌伴神经浸润动物模型的建立目的：本实验拟通过运用人胰腺癌细胞株注射BALB/c裸小鼠坐骨神经周围建立胰腺癌伴神经浸润的动物模型，通过不同注射方法及不同人胰腺癌细胞株的对比，筛选适宜的注射方法及细胞株，建立一种造模时间短、操作简单、易行，复制率高，相对稳定的胰腺癌伴神经浸润的动物模型。方法：通过使用神经浸润能力有差异的人胰腺癌细胞株Capan-2、Panc-1及细胞增殖快、造模时间短的细胞株SW1990，选择单纯经皮穿刺坐骨神经周围注射人胰腺癌细胞株成瘤、切开定位坐骨神经周围注射、BD Matrigel基质胶与人胰腺癌细胞混悬液包裹坐骨神经注射3种不同的人胰腺癌细胞注射方法，建立肿瘤神经浸润的动物模型。观察不同成瘤方法及不同细胞株的成瘤情况、成瘤率及PNI发生率，对比分析其差异性。结果：1、荷瘤裸鼠体重随着荷瘤时间的延长及肿瘤的增长，总体呈现下降趋势，甚至出现恶液质，但随着肿瘤的体积的增大，部分荷瘤裸鼠体重有上升趋势。2、方法一的PNI发生率最低，方法三的成瘤时间短、成瘤率高、PNI发生率最高，方法二则居中。3、SW1990细胞株成瘤时间短，Capan-2细胞株PNI发生率高，Panc-1成瘤时间最长、PNI发生率最低。结论：本实验经过多种造模方式的对比研究，最终成功建立了操作方便，复制率高的胰腺癌PNI动物模型。不同的细胞株具有不同的特点，不同的实验目的可选择不同的细胞株造模。三、TRIP6在胰腺癌伴神经浸润动物模型中的表达目的：检测TRIP6在不同组织、存在PNI动物模型及无PNI动物模型中的表达，观察TRIP6在体内水平表达的差异，进一步探讨TRIP6对于胰腺癌进展及PNI发生的作用机制。方法：选择经前阶段实验验证的TRIP6高表达且PNI发生率高的人胰腺癌细胞株Capan-2，使用BD Matrigel基质胶与人胰腺癌细胞混悬液包裹坐骨神经注射的方法建立体内PNI动物模型，另用人胰腺癌细胞株Capan-2裸鼠皮下注射的方法建立无PNI存在的动物模型，运用RT-PCR、western-blot及免疫组织化学的方法，检测TRIP6在正常裸鼠胰腺组织、神经组织、存在PNI及无PNI动物模型瘤体组织中的不同水平的表达及定位。结果：1、正常裸鼠胰腺组织及神经组织中均未检测到TRIP6mRNA及相关蛋白的表达，Capan-2坐骨神经注射组、Capan-2皮下注射组中均可见TRIP6mRNA及相关蛋白的表达，组间mRNA及蛋白表达水平均具有统计学意义（P<0.05），坐骨神经注射组均高于皮下注射组。2、免疫组织化学染色结果显示TRIP6即可在胞浆表达，也可在胞核表达，以胞浆内表达为主。Capan-2坐骨神经注射组的阳性表达多于皮下注射组（P<0.05）。且在被癌细胞浸润的神经周围可见有强表达。结论：TRIP6在正常胰腺组织及神经组织中无表达，但在瘤体组织中有表达，存在PNI的瘤体中TRIP6的相关表达均高于无PNI组，由此进一步说明TRIP6与胰腺癌进展及PNI发生相关，考虑其通过对癌细胞的调控实现，但其具体机制仍待进一步发掘。四、抑制TRIP6表达对人胰腺癌细胞株的影响目的：通过抑制TRIP6的表达，观察其对人胰腺癌细胞株迁移、侵袭能力及凋亡的影响，进一步探讨TRIP6在胰腺癌进展中的具体作用机制。方法：运用siRNA瞬时转染人胰腺癌细胞株Capan-2、Panc-1，通过RT-PCR及western-blot验证转染干扰效果，明确相对稳定干扰后，运用Costar8μm Transwell小室行胰腺癌细胞迁移实验、BD Matrigel侵袭小室行胰腺癌细胞侵袭实验、流式细胞仪检测不同细胞株凋亡情况，分析抑制TRIP6表达后对胰腺癌细胞生物学特性的改变，明确TRIP6对于胰腺癌进展、PNI发生的具体作用机制。结果：1、经siRNA瞬时转染人胰腺癌细胞株后，对照组TRIP6mRNA及蛋白表达水平均高于siRNA转染组（P<0.05），证实干扰效果相对稳定；2、经siRNA干扰抑制TRIP6表达后，迁移、侵袭实验结果显示各细胞株穿过膜的细胞数均明显下降（P<0.05）；3、经抑制TRIP6表达后，流式细胞仪检测可见干扰组胰腺癌细胞凋亡多于阴性对照组（P<0.05），主要集中在凋亡早期。结论：在体外经抑制TRIP6表达后人胰腺癌细胞的迁移、侵袭及抗凋亡能力均明显下降，进一步研究发现TRIP6可通过促进癌细胞的迁移、增强侵袭及抗凋亡能力，促进胰腺癌的进展及PNI的发生。