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越来越多的研究表明活性氧（ROS）介导的氧化损伤在许多心血管疾病的病理过程中都起很重要的作用。ROS是指一组化学性质活泼的具有含氧基团的化合物，自由基是最主要的活性氧。ROS过度增加或持续存在可对细胞形成氧化应激，可造成多种损伤，包括：细胞膜的脂质过氧化、蛋白变性或交联和DNA的损伤，从而影响细胞的完整性和功能。高浓度的ROS由于大大超过了细胞自身的抗氧化防御能力，往往迅速导致细胞不可逆的损伤和死亡，而低浓度的ROS，尤其是H2O2和·OH，可通过多种细胞内信号转导机制影响细胞的功能，机制比较复杂。因此研究低浓度的ROS对细胞的影响，寻找合适的保护性药物显得很为重要。H2O2不仅是一种ROS，而且是研究ROS的重要工具；它可以迅速地穿过细胞膜，通过Fention反应，生成更有害的·OH；·OH反过来又可以激发链式反应，产生更多的ROS。因此，可以用它来模拟ROS对心肌细胞的损伤。 褪黑素（MT）是一种主要由松果体细胞分泌的吲哚类神经内分泌激素。近年来发现MT不仅具有多种生理功能而且是一种强大的自由基清除剂，而机体MT的分泌是随着年龄的增加逐渐下降的。研究表明药物剂量的MT可以抑制氧化损伤，生理浓度的MT也可以保护耗氧量大的组织中自由基对生物大分子的损伤。MT抑制氧化损伤的途径是多种多样的。MT能直接有效地清除·OH、OZ”、NO、ONOO”等自由基，能抑制不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应。另外，MT还可增强多种抗氧化酶的活性，包括：超氧化歧化酶、谷眺甘肽还原酶、谷脱甘肽过氧化物酶，抑制促氧化酶和NO合成酶的活性，从而起间接保护作用。MT还可以鳌合过度金属离子，防止细胞膜的变性；可以有效地防止自由基对DNA和细胞膜脂质的破坏。MT的这些作用在心血管疾病、神经退行性病变和衰老方面都很有价值。另一方面，MT无毒副作用，容易穿过各种生理屏障，易于进入亚细胞结构，使其有别于其他抗氧化剂。本文旨在用 100 n moMi过氧化氢模拟低浓度ROS对心肌细胞的氧化损伤；探讨MT对心肌细胞的保护作用。具体研究内容如下： 一，心肌细胞的原代培养 在细胞水平进行心肌损伤及保护因素的研究是近年国内外发展的方向，其最大的优点在于排除了血液、神经和局部不同类型细胞间的相互影响。细胞培养技术可控性、重复性好，为研究单一因素对心肌细胞的影响提供了便利条件。本研究采用胰酶消化法分离SD乳鼠心室肌细胞，差速贴壁纯化后，按不同的浓度接种后培养3．5天，用于实验。按照实验的不同，细胞随机分组：①对照组：加入等量的HBSS缓冲液作空臼对照；②H。O。组：加入用 HBSS缓冲液配制的 H。Oh 终浓度 100 11 mol／L；③MT组：加用 nSS缓冲液配制的 MT，终浓度 100 n moTh；④MT＋H刃。：先 V ？加 MT终浓度 100 卜 moW，l而n后再力 H。O。（终浓度 100 11 moW。 二．细胞的搏动频率及形态学观察 众说周知缺血后再灌注可诱发再灌注性心律失常，且再灌注性心律失常与心室肌细胞自律性的变化密切相关卜心肌细胞一般在接种24h后便可见细胞间建立连接和不规律搏动，2－3天后细胞自发搏动趋于规律。在倒置显微镜下观察心肌细胞搏动频率的变化可以反映出心肌细胞自律性的变化。HZOZ处理后细胞搏动频率先有一个增加的过程，而后迅速下降，最后停止搏动。MT干预后，HZOZ刺激引起的频率增加效应消失。 HZOZ处理1小时后，可见全部细胞的均停止自发搏动，细胞间连接减少，细胞伪足收缩，少数细胞胞体变圆、肿胀甚至悬浮。继续培养24h后HZOZ组可见大量的细胞漂浮、死亡等变化；存活的细胞虽形态无明显改变，但仅能见到个别细胞的自发搏动。而MT＋H刃。组和对照组细胞生长良好。MT能够逆转HZOZ引起的细胞的这些变化。 三．心肌细胞线粒体脱氢酶活性的测定 活细胞线粒体中含有脱氢酶。脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物0ormazan）并沉积在细胞中。用二甲基哑矾使其溶解后，检测其光密度值的大小可以反映Formazan的多少，同时也反映了线粒体酶活性的强弱。结果发现：细胞存活率，前40min内并无变化，而随着HZOZ作用时间的延长，细胞线粒体酶活性逐渐减低，HZOZ组组内差异显著(尸＜0刀1L 表明N0。可以损害线粒体的功能。用＊T预处理后，OD。。。值的下降明显减弱，MT＋H。O。组内无差异（P＞0刀5）；MT＋H。O。组与N0。处理组之间相比，组间差异显著（尸＜O．01），说明＊T可以抑制氧化应激中心肌细胞线粒体酶活性的降低，具有保护心肌细胞的作用。 VI 8四．应用LSCM观察细胞内ROS和［Cahl；的短时间内（4分钟）的变化 分别用 ROS敏感性荧