香石竹AGAMOUS基因的功能分析

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素有“母亲节之花”雅称的香石竹作为观赏植物,因其高度重瓣性、观赏周期长等突出的经济和商业价值而广泛应用于营造花坛、花镜以及室内装饰等。经典的花发育ABC模型已经阐明C类基因对于植物生殖生长具有重要作用,然而,AG基因正是执行C类功能调控雄蕊和心皮的发育以及决定花分生组织的确定性的主导元素。此外,作为最大的MADS-box基因家族成员的AG在被子植物中一直以一种高度保守的方式行使C类功能。核心双子叶植物中,两个共存的基因分支eu AG和PLE均存在于拟南芥和金鱼草中,并且强烈的亚功能分化导致均控制C类功能的两个分支产生高度的功能差异。香石竹处于基部双子叶植物之后的进化地位,先于蔷薇目和菊目植物分化,其AG基因的组成、功能以及进化关系等尚不明确,仍有待进一步探究。本研究基于香石竹基因组数据库,通过生物信息学手段,全基因组范围内搜索香石竹AG同源基因,并对其基因结构、保守结构域、调控元件以及表达定位等进行预测和分析。通过RT-PCR与q RT-PCR技术对AG基因在不同瓣型的香石竹花芽和重瓣‘马斯特’的不同花器官中表达模式进行了探究。在此基础上,借助拟南芥花序浸染法和香石竹农杆菌介导法对DcaAG基因进行功能上的初探。主要结果如下:1.采用同源性搜索方法和常规PCR扩增,鉴定并克隆出两个DcaAG基因:DcaAGa和DcaAGb。系统进化分析显示这两个基因均属于eu AG分支,同时氨基酸序列比对发现,它们都拥有MADS-box基因完整的M、I、K、C结构域,并且在相对最不保守的C端发现AG类家族基因独有的两个基序AG I与AG II。2.基因结构分析显示香石竹AG基因结构相对保守。探究DcaAG最大内含子发现,两个AG基因均存在保守的LFY结合位点和大量的光响应、胁迫响应以及激素响应等原件,说明它们可能参与了早期花分生组织发育过程和花发育相关的胁迫、激素等途径的调控作用。亚细胞定位分析说明香石竹AG基因在细胞核中表达,可能是转录因子。3.半定量分析结果说明DcaAG在不同瓣型的香石竹中表达差异明显。实时荧光定量分析结果表明重瓣‘马斯特’中DcaAG基因均只在雄蕊与心皮中表达,萼片和花瓣中几乎没有表达,并且DcaAGb在雄蕊和心皮中表达量均低于DcaAGa,表明DcaAG基因在花器官形成阶段可能只参与雄蕊和心皮的调控。4.建立了不同瓣型香石竹无菌体系并构建了DcaAG基因的超量表达、RNAi干涉以及VIGS干涉等载体。在此基础上,分别进行两个基因的拟南芥异源转化和香石竹同源转化,筛选出DcaAGa和DcaAGb超量表达载体转化拟南芥T1代和T2代转基因株系并得到了DcaAGb缺失突变转化香石竹T0代转基因株系。拟南芥T1代转基因株系表型鉴定结果显示,35S:DcaAGa和35S:DcaAGb株系幼苗期均出现叶片窄小、上卷和生长畸形等特征,仅仅不同株系特征强度不同;并均有叶片表皮毛明显减少和开花时间显著提前的现象。然而,在35S:DcaAGa和35S:DcaAGb株系生殖器官形成阶段,均出现了不同强度表型的分离:弱表型与野生型植株无太大差异,中表型出现花瓣明显变短甚至部分消失,强表型则花瓣完全消失导致心皮富集。同时,它们的强表型株系均产生高度不育性状,中表型株系的果实均出现长角果变短且果荚靠近顶端部分褶皱、凸起严重等现象。此外,T2代转基因株系均表现出T1代弱表型株系特征,即仅保留叶片表皮毛明显减少和开花时间显著提前的变化。荧光定量结果说明相比较于35S:DcaAGa株系,在35S:DcaAGb株系中引起花器官特征改变的相关基因的变化幅度明显偏高。这些表型结果和分析表明香石竹中两个eu AG基因在功能上可能产生冗余现象,并且在执行这种功能上DcaAGb可能更加敏感。
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