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肝纤维化属于病理过程,是许多慢性肝病演变成肝硬化的表现。它是由于细胞外的基质异常增生与过度沉积使得肝脏结构发生病理性改变,与炎症反应密切相关。从细胞层面解读,肝纤维化是肝硬化乃至肝癌的必经之路,由肝星状细胞增殖表达致使胞外基质的增生异常与抑制其降解。一氧化氮具有脂溶性,为自由基性质气体,它与活性氧可生成为活性氮,进而生成硝基酪氨酸,大剂量的一氧化氮的产生会引起肝毒性致使肝脏损伤,然而一定浓度的一氧化氮会抑制肝星状细胞的增殖,同时可以降低肝星状细胞中蛋白的表达以及抑制一型胶原基因合成。一氧化氮合酶的表达可刺激一氧化氮的生成和活化,丹参具有活血祛瘀的作用,其有效的提取物丹参酮ⅡA可以有效促进一氧化氮的合成,提出此理论对防治肝纤维化意义重大,这为中医抗肝纤维化提供了有力的科学证据。
本文的研究分为三部分:
第一部分:丹参酮ⅡA对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成的影响
目的:一氧化氮具有扩张血管等作用,是重要的神经递质、第二信使。本文对原代分离培养的肝窦内皮细胞,以及原代肝窦内皮细胞损伤模型作为研究样本,运用激光共聚焦荧光显微镜,一氧化氮探针安装,对不同浓度的丹参酮ⅡA作用于肝窦内皮细胞损伤模型一氧化氮合成情况的观察,明确不同浓度的丹参酮ⅡA对损伤后肝窦内皮细胞生物学影响力。方法:对纤维化血清损伤后的原代肝窦内皮细胞安装一氧化氮探针DAF-FMDA。用PBS缓冲盐溶液作为空白对照组,实验组丹参酮ⅡA分为低浓度组50ug/ml,中浓度组100ug/ml,高浓度组200ug/ml,运用激光共聚焦荧光显微镜,对安装一氧化氮探针DAF-FMDA的损伤后肝窦内皮细胞实时监测,按照10s/帧对样本进行拍照,在500s时加入药物或者PBS缓冲盐溶液,观察荧光曲线有何变化,并绘制曲线图。结果:空白对照组在滴加PBS后荧光曲线并无明显变化,整体趋势呈缓慢下降趋势。丹参酮ⅡA50ug/ml低浓度组,在500s加药后荧光曲线上升趋势约为5%,丹参酮ⅡA100ug/ml中浓度组在500s加药后平均荧光曲线呈快速上升趋势,上升约为10%,丹参酮ⅡA200ug/ml高浓度呈上升趋势,上升约为10%。结论:一氧化氮探测在光照射下会有淬灭,丹参酮ⅡA可使损伤后的肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成增加,扩张肝血管改善肝脏内血液循环。
第二部分:丹参酮ⅡA对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合酶表达的影响
目的:一氧化氮合酶的表达增加增加了一氧化氮的生成,一氧化氮对肝脏血液循环具有积极的影响,并且可以抑制肝星状细胞的生成从而降低肝纤维化的发生。利用RT-PCR检测不同药物浓度中肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合酶mRNA中的表达影响,明确了不同的药物浓度对一氧化氮合酶mRNA的作用。方法:正常原代体外肝窦内皮细胞滴加PBS溶液为阴性对照组,损伤后肝窦内皮细胞滴加PBS为阳性对照组,丹参酮ⅡA50ug/ml为低浓度组,丹参酮ⅡA100ug/ml为中浓度组,丹参酮ⅡA200ug/ml为高浓度组,收集每组细胞胞内总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,加入扩增引物,将扩增物用紫外线摄片,进行图像分析。结果:空白对照组中一氧化氮合酶都处于低浓度表达。药物组随着药物浓度的增高,一氧化氮合酶表达逐渐增高,明显高于空白对照组。结论:丹参酮ⅡA对损伤后肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合酶表达具有促进作用。
第三部分:丹参酮ⅡA对肝窦内皮细胞杨氏模量的影响
目的:实验研究运用了原子力显微镜,对待体外大鼠肝窦内皮细胞中细胞膜硬度的测量,体现了低中高浓度对肝窦内皮细胞的力学性质的作用。方法:实验将细胞分为正常肝窦内皮细胞阴性对照组,损伤肝窦内皮细胞为阳性对照组,丹参酮ⅡA药物低中高浓度组,针对组中细胞膜硬度的测量。结果:每个细胞选取4个点,一组中选取10个细胞测量,用SPASS统计分析数据,药物组比较对照组有统计学差异。结论:丹参酮ⅡA能够通过对肝窦内皮细胞细胞膜的硬度造成改变,其变硬后,可能减小了血管的阻力从而改善血液循环。
本文的研究分为三部分:
第一部分:丹参酮ⅡA对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成的影响
目的:一氧化氮具有扩张血管等作用,是重要的神经递质、第二信使。本文对原代分离培养的肝窦内皮细胞,以及原代肝窦内皮细胞损伤模型作为研究样本,运用激光共聚焦荧光显微镜,一氧化氮探针安装,对不同浓度的丹参酮ⅡA作用于肝窦内皮细胞损伤模型一氧化氮合成情况的观察,明确不同浓度的丹参酮ⅡA对损伤后肝窦内皮细胞生物学影响力。方法:对纤维化血清损伤后的原代肝窦内皮细胞安装一氧化氮探针DAF-FMDA。用PBS缓冲盐溶液作为空白对照组,实验组丹参酮ⅡA分为低浓度组50ug/ml,中浓度组100ug/ml,高浓度组200ug/ml,运用激光共聚焦荧光显微镜,对安装一氧化氮探针DAF-FMDA的损伤后肝窦内皮细胞实时监测,按照10s/帧对样本进行拍照,在500s时加入药物或者PBS缓冲盐溶液,观察荧光曲线有何变化,并绘制曲线图。结果:空白对照组在滴加PBS后荧光曲线并无明显变化,整体趋势呈缓慢下降趋势。丹参酮ⅡA50ug/ml低浓度组,在500s加药后荧光曲线上升趋势约为5%,丹参酮ⅡA100ug/ml中浓度组在500s加药后平均荧光曲线呈快速上升趋势,上升约为10%,丹参酮ⅡA200ug/ml高浓度呈上升趋势,上升约为10%。结论:一氧化氮探测在光照射下会有淬灭,丹参酮ⅡA可使损伤后的肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成增加,扩张肝血管改善肝脏内血液循环。
第二部分:丹参酮ⅡA对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合酶表达的影响
目的:一氧化氮合酶的表达增加增加了一氧化氮的生成,一氧化氮对肝脏血液循环具有积极的影响,并且可以抑制肝星状细胞的生成从而降低肝纤维化的发生。利用RT-PCR检测不同药物浓度中肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合酶mRNA中的表达影响,明确了不同的药物浓度对一氧化氮合酶mRNA的作用。方法:正常原代体外肝窦内皮细胞滴加PBS溶液为阴性对照组,损伤后肝窦内皮细胞滴加PBS为阳性对照组,丹参酮ⅡA50ug/ml为低浓度组,丹参酮ⅡA100ug/ml为中浓度组,丹参酮ⅡA200ug/ml为高浓度组,收集每组细胞胞内总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,加入扩增引物,将扩增物用紫外线摄片,进行图像分析。结果:空白对照组中一氧化氮合酶都处于低浓度表达。药物组随着药物浓度的增高,一氧化氮合酶表达逐渐增高,明显高于空白对照组。结论:丹参酮ⅡA对损伤后肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合酶表达具有促进作用。
第三部分:丹参酮ⅡA对肝窦内皮细胞杨氏模量的影响
目的:实验研究运用了原子力显微镜,对待体外大鼠肝窦内皮细胞中细胞膜硬度的测量,体现了低中高浓度对肝窦内皮细胞的力学性质的作用。方法:实验将细胞分为正常肝窦内皮细胞阴性对照组,损伤肝窦内皮细胞为阳性对照组,丹参酮ⅡA药物低中高浓度组,针对组中细胞膜硬度的测量。结果:每个细胞选取4个点,一组中选取10个细胞测量,用SPASS统计分析数据,药物组比较对照组有统计学差异。结论:丹参酮ⅡA能够通过对肝窦内皮细胞细胞膜的硬度造成改变,其变硬后,可能减小了血管的阻力从而改善血液循环。