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产KPC型碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC)细菌自2001年被发现以来就迅速在多个国家和地区蔓延,并逐年增加,由于缺乏针对由这类细菌引起感染的有效治疗药物,因此产KPC酶细菌的流行已成为全球抗感染的难题,有关KPC的研究已成为抗感染领域专家研究的重点之一。由于产KPC酶细菌在很短时间内在多个国家和地区被快速分离到,而且大多数国家中第一例携带产KPC酶细菌的患者均无流行病学史,几乎所有国家第一例被分离到的产KPC酶细菌均为肠杆菌科细菌,所以我们推断肠道微生物生态系统在产KPC酶细菌的发生发展上起到重要作用。为了探索肠道微生物生态系统在产KPC酶细菌产生上的作用及碳青霉烯类抗生素耐药菌定植与肠道微生物生态系统的相互作用关系,本研究从以下几个方面进行了研究。一、ICU患者肠道碳青霉烯类抗生素不敏感菌的分离状况研究本研究收集了我院重症监护室(Intensive Care Unit,ICU)247个患者从入ICU第一天起每五天一次直至出院的粪便/直肠拭子标本,共429份。用含1μg/ml美罗培南的麦康凯平板培养基对这429份标本进行了培养,共得到细菌286株。对这286株细菌进行了鉴定和药物敏感性(简称药敏)试验,其中171株对美罗培南或亚胺培南耐药或中度敏感,剔除重复菌株后得到119株碳青霉烯类抗生素不敏感细菌,携带率为48.2%(119/247)。对这119株细菌进行了菌种分布及耐药性的分析,并用脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)分析了其中的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和植生拉乌尔菌的同源性。和同年ICU临床分离株的相应结果进行比较后发现肠道分离的碳青霉烯类抗生素不敏感菌中有一些临床不常见细菌,如植生拉乌尔菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、多食博克霍尔德菌、甜菜假单胞菌、弯曲假单胞菌、少动嗜铜菌等,这些细菌可能成为新耐药菌产生的“储备库”。还发现肠道分离的碳青霉烯类抗生素不敏感菌中肠杆菌科细菌比例为31.1%,明显高于临床分离株的12.1%,这符合肠道菌群构成特点。PFGE发现肠道分离菌的同源性显著低于临床分离株,这也表明肠道分离的碳青霉烯类抗生素不敏感菌并非来自医院流行的克隆,同时这种克隆多样性也增加了新的耐药克隆产生和流行的概率。这些不同于临床分离株的特点提示了肠道中碳青霉烯类抗生素不敏感菌的发生发展有其独特的规律。二、用PCR法检测肠道分离的blaKPC阳性细菌并探索其产生机制本部分用PCR法检测了所有286株从粪便/直肠拭子中筛查到的细菌及从429份粪便/直肠拭子提取的宏基因组中的KPC酶编码基因(blaKPC)。共检测到40株blaKPC阳性细菌,有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、植生拉乌尔菌和奇异变形杆菌,其携带的KPC均为KPC-2。分别用Etest、PFGE、接合试验、转化试验、Southern杂交及PCR步移法对在我国首次发现的3株blaKPC阳性铜绿假单胞菌和2株blaKPC阳性植生拉乌尔菌进行了耐药性、同源性、blaKPC基因定位及其基因环境研究。发现3株铜绿假单胞菌为同一克隆(PFGE型相同,序列分型均为ST463),均为全耐药菌,携带多种耐药基因(PER、TEM-1、aac(3)-Ⅱ,aac(6’)-Ⅱ及rmtB)并缺失oprD2基因。它们的blaKPC定位在染色体上,blaKPC基因及周围的2646-bp核苷酸序列和中国流行的blaKPC-2周围结构的变异体2相同。2株植生拉乌尔菌为不同克隆,但都为除了对多粘菌素B和多黏菌素敏感外的广泛耐药菌株,都携带CTX-M-1、TEM-1和qnrA基因。blaKPC定位在质粒上,包括blaKPC在内的7498-bp周围序列和在中国流行的质粒pKP048携带的blaKPC-2两侧的序列完全一致。有12份粪便/直肠拭子标本能直接从DNA中扩增到blaKPC,但不能用传统方法培养到blaKPC阳性的细菌。这可能是因为blaKPC存在于常规培养不能得到的细菌中。这些细菌可能正是产KPC酶肠杆菌科细菌产生的源头。三、碳青霉烯类抗生素耐药菌定植的肠道微生物分子生态特征研究本部分应用多末端限制性片段长度多态性(Multiplex-terminal restrictionfragment length polymorphism,M-TRFLP)技术,对三组标本(①无碳青霉烯类抗生素耐药菌定植组20份,②KPC阴性碳青霉烯类抗生素耐药菌定植组20份,③KPC阳性碳青霉烯类抗生素耐药菌定植组20份)进行了细菌、真菌及古菌的多样性分析。发现碳青霉烯类抗生素耐药菌定植时真菌和古菌的末端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)有显著改变,揭示了肠道微生物生态失衡与耐药菌定植密切相关。以上研究表明:1.肠道分离的碳青霉烯类抗生素不敏感菌有不同于临床分离菌的显著特征:(1)肠杆菌科细菌比例明显高于临床分离株,这符合肠道菌群构成特点。(2)肠道内有临床不常见的碳青霉烯类抗生素不敏感菌,这些细菌可能成为新耐药菌产生的“储备库”。(3)肠道分离的碳青霉烯类抗生素不敏感菌同源性明显低于临床分离细菌,说明这些细菌不是临床流行的克隆传播所致,同时这种克隆多样性增加了新的耐药克隆产生和流行的概率。2.blaKPC可能存在于常规手段培养得不到的细菌上,这些细菌可能是产KPC酶肠杆菌科细菌产生的源头。3.我们首次在国内分离到了产KPC酶铜绿假单胞菌和植生拉乌尔菌,它们分别为全耐药菌和广泛耐药菌,携带的blaKPC分别定位于染色体和质粒上。铜绿假单胞菌的blaKPC基因及周围的2646-bp核苷酸序列和中国流行的blaKPC-2周围结构的变异体2相同。植生拉乌尔菌的blaKPC基因及两侧7498-bp的序列和在中国流行的质粒pKP048携带的blaKPC-2两侧的序列完全一致。4.耐药菌定植与无耐药菌定植时的肠道真菌及古菌的种群结构有明显差异,揭示了耐药菌的生长繁殖与肠道微生态失衡密切相关。