论文部分内容阅读
研究背景在肿瘤治疗中,化疗始终占据着非常重要的角色。传统化疗药物的特点是非选择性杀伤生长活跃的细胞。在一定程度上控制肿瘤进展,同时却也带来了全身的毒副作用,限制化疗药物在临床的使用。此外,不同于正常组织的血管,肿瘤血管因其血管内皮细胞间连接疏松、血管壁周细胞不足等原因,使其具备高通透性的特点;由于渗漏及肿瘤异常增殖造成的血管压缩,这促使肿瘤血管具备有严重的血液低灌注性并造成高间隙液压的肿瘤微环境。而肿瘤血管的这些特性,往往导致化疗药物不能有效的输送至肿瘤的深部,达不到有效的治疗浓度,在影响治疗疗效的同时,容易诱发肿瘤的高侵袭性和多重化疗耐药等后果。基于此,癌症纳米医学新兴发展,目前已应用于癌症的成像、诊断、治疗及预防的方方面面。其中,以金纳米颗粒（Gold nanoparticles,AuNPs）为药物传递载体的研究如火如荼的开展。AuNPs能有效抵抗肿瘤微环境中的高间隙液压而积聚于肿瘤组织中。同时,AuNPs极易通过表面功能化修饰而具备酸敏感、靶向特异性肿瘤、延长其半衰期和生物体内代谢等诸多性能,故能有效地提高抗肿瘤疗效。因此,对AuNPs进行更稳定化、更精准化的化学生物修饰,是促进AuNPs更广泛地应用于抗肿瘤治疗的基石。有研究发现AuNPs本身即具备抗肿瘤特性,而更多的研究主要涉及对载药的AuNPs表面功能化修饰,通过提高其靶向性和循环生物利用度来增强化疗药物的疗效。目前针对AuNPs调控肿瘤血管正常化方向的研究报道仍不充分。以AuNPs为基础的新型纳米材料能否参与改造肿瘤微环境,促进肿瘤血管正常化,抑制肿瘤转移的具体机制的研究需要进一步阐释。本研究以AuNPs出发,结合大多数实体肿瘤高表达叶酸受体的特点,通过构建以聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）和2-（二乙氨基）丙烯酸乙酯（2-（diethylamino）ethyl acrylate,DEAEA）为成分的两亲性嵌段共聚物 PEG-PDEAEA,加以叶酸的表面功能化修饰,最终形成新型金纳米颗粒AuNPP-FA。拟结合分子生物学实验及体内外细胞动物实验,探究AuNPP-FA对多种肿瘤的抗肿瘤特性、明确AuNPP-FA是否参与调控肿瘤微环境中血管内皮细胞而促进肿瘤血管正常化,为确立AuNPP-FA有效应用于抗肿瘤治疗提供有力的临床前研究。研究假设1.AuNPP-FA具备良好的稳定性、靶向性,能特异性地被肿瘤组织摄取;2.AuNPP-FA能有效的杀伤肿瘤细胞、且无明显的毒副作用;3.AuNPP-FA可能参与肿瘤微环境的改造,抑制肿瘤的增殖和转移;4.AuNPP-FA在参与微环境改造中,有可能是影响血管内皮细胞的功能,促进肿瘤血管正常化,发挥抑制肿瘤转移的作用;5.在肿瘤免疫治疗中,抗PD-L1联合化疗、AuNPP-FA的综合治疗可提高肿瘤治疗疗效。研究方法1.AuNPP-FA的制备及表征首先,利用可逆加成-断裂链转移聚合反应将PEG、DEAEA合成共聚物PEG-PDEAEA,利用酰胺化反应及缩合反应将FA或带有荧光的-cy3/-cy7连接在PEG-PDEAEA上,通过离子相互作用与硼氢化钠合成法合成的AuNPs自组装形成AuNPP、AuNPP-FA、带有荧光基团或化疗药物的AuNPP材料等。其次,利用核磁共振氢谱（1H NMR）、傅氏转换红外线光谱仪验证AuNPP-FA及其余衍生材料制备成功;利用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射仪（DLS）测定AuNPP-FA的表面形态、大小、电势及稳定性。接着利用CCK8法检测制备合成的多种材料的抗肿瘤特性;然后利用TEM和免疫荧光、流式细胞技术、荷瘤小鼠乳腺原位癌模型及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）探究AuNPP-FA的良好靶向性和体内生物分布情况。2.AuNPP-FA对肿瘤体内外生物学功能的影响首先,利用AuNPP-FA刺激肿瘤细胞,通过平板克隆实验、EdU增殖实验、划痕实验验证AuNPP-FA对肿瘤细胞增殖迁移的影响;其次,构建裸鼠胃癌皮下瘤模型和BALB/c小鼠乳腺原位癌模型,通过每日腹腔注射适量的AuNPP-FA,检测AuNPP-FA在体内对肿瘤增殖和转移的影响;利用尾静脉肺转移模型和自发转移小鼠模型进一步探讨AuNPP-FA作用于肿瘤体内转移的具体阶段;最后通过HE染色,体重,血常规血生化及二便常规的检测评估AuNPP-FA的体内安全性。3.AuNPP-FA对肿瘤血管新生和肿瘤血管正常化的影响荷瘤小鼠在经过AuNPP-FA腹腔注射治疗处理后,利用免疫荧光染血管指标CD31、扫描电子显微镜检测肿瘤血管内皮细胞连接情况;利用免疫荧光染α-SMA、VE-cadherin和CD31评估周细胞覆盖率和血管内皮细胞间连接情况;通过尾静脉注射血管凝集素、葡聚糖、哌莫硝唑,检测血管灌注、渗漏及组织缺氧情况;利用免疫荧光和组化检测肿瘤组织中细胞毒性T淋巴细胞浸润情况和PD-L1的表达;利用抗PD-Ll联合AuNPP-FA的综合治疗方案评估肿瘤治疗疗效;制备条件培养基,比较有无AuNPP-FA刺激后的肿瘤条件培养基对血管内皮细胞增殖、迁移的影响及血管内皮细胞静息态、血管正常化的检测。4.AuNPP-FA诱导肿瘤细胞-血管内皮细胞相互作用的机制初探利用Real-time PCR、Western blot及ELISA试剂盒检测多种肿瘤细胞经AuNPP-FA刺激后,各类促/抑血管生长因子的表达变化;利用Western blot检测条件培养基刺激血管内皮细胞后,血管内皮细胞内部信号通路的变化;在明确SEMA3A为表达变化最明显的分泌蛋白后,利用重组的人源性蛋白SEMA3A刺激血管内皮细胞,或者利用干扰片段敲低血管内皮细胞表面SEMA3A的受体NRP-1表达,Western blot检测血管内皮细胞信号通路的变化情况。结果1.AuNPP-FA具有良好的稳定性、靶向性,产生杀伤肿瘤的作用通过两步连续的可逆加成-断裂链转移聚合反应（RAFT）,我们制备获得了聚乙二醇-b-聚丙烯酸二乙氨基乙酯（PEG-PDEAEA）两亲二嵌段共聚物。利用核磁共振氢谱（1H NMR）检测到信号值在6.0-8.5ppm间的叶酸特征峰,红外线光谱可见仲酰胺C=O伸缩及酰胺基上的C-N伸缩和N-H弯曲,证明叶酸已通过酰胺化成功共轭连接至PEG-PDEAEA,形成PEG-PDEAEA-FA,最后通过静电作用和AuNPs自组装形成AuNPP-FA。类似的方法,我们还合成了 MPAAu,PEG-SHAu 和 AuNPP、AuNPP-FA-cy3/cy7、AuNPP-Dox、AuNPP-Dox-FA 等衍生材料。利用透射电子显微镜及动态光散射仪观察到AuNPP-FA为偏均匀单分散的球形金纳米颗粒,在PBS溶液中的直径约为1-6nm范围内,电势波动小且相对稳定性高,能在水溶液中稳定存在。利用CCK8实验发现与载有阿霉素的AuNPP-FA相比,AuNPP-FA也同样表现出很好的肿瘤细胞杀伤作用,故本次研究中首先筛选AuNPP-FA为主要对象进行研究。我们在验证完多种肿瘤细胞均高表达叶酸受体后,利用透射电子显微镜、免疫荧光、流式细胞术发现,AuNPP-FA被肿瘤细胞摄取的数量明显高于单纯的AuNPP组。利用小鼠乳腺原位癌模型检测AuNPs在体内的分布情况,结果发现AuNPP-FA在肿瘤部位蓄积明确,且明显优于AuNPP组。同时,随着时间的推移,AuNPP-FA组的仍可检测到更多的材料荧光信号;对小鼠的器官进行成像后,AuNPP-FA组的肿瘤组织有更多的材料蓄积,此外材料在肾脏蓄积程度最高。最后通过ICP-MS技术发现尿液中有大量Au排除,证实AuNPP-FA通过肾脏代谢为主要代谢途径。2.AuNPP-FA在体内能有效抑制肿瘤增殖和转移、在体外仅发挥抗增殖作用在体外实验中,通过平板克隆、EdU实验、划痕实验证实AuNPP-FA能有效地抑制肿瘤的增殖,而对肿瘤迁移无影响;在体内实验中,利用荷瘤小鼠模型,证实AuNPP-FA能明显的抑制肿瘤增殖和转移的发生。同时,利用HE染色、体重、血常规血生化、尿便常规等指标检测证明AuNPP-FA在动物体内对主要脏器的毒副作用弱,其安全性强、生物相容性高。3.AuNPP-FA促进肿瘤血管正常化利用AuNPP-FA腹腔注入治疗后,免疫荧光实验检测CD31、扫描电镜观察血管情况,结果示AuNPP-FA组肿瘤新生血管数量明显减少,且肿瘤血管内皮细胞连接更为紧密。此外对周细胞、血管内皮间连接蛋白VE-cadherin进行免疫荧光检测,得到一致的结果:AuNPP-FA组血管覆盖的周细胞数量增多,血管内皮细胞间连接明显增强。这标志着血管成熟化、功能化、正常化。在血管功能方面,利用番茄凝集素、葡聚糖、盐酸哌莫硝唑尾静脉注射后的免疫荧光结果证明AuNPP-FA组血管灌注增多,渗漏减少,缺氧情况得到明显改善。在肿瘤血管正常化进程中,细胞毒性T淋巴细胞浸润增多。同时利用抗PD-L1联合紫杉醇,AuNPP-FA后,能显著抑制肿瘤的增殖和转移。体外实验中,利用条件培养基对HUVEC刺激后,发现与单纯肿瘤条件培养基相比,带有AuNPP-FA刺激后的肿瘤上清能有效降低HUVEC的渗透性和迁移能力,HUVEC表达VE-cadherin 增加,血管内皮细胞静息态指标 Ki-67 表达下降而 IL33 的表达明显上升。利用Western blot检测血管正常化指标PHD2在刺激组也得到了明显的抑制,证明AuNPP-FA刺激后的肿瘤上清能有效的促进肿瘤血管内皮细胞处于静息态,导致肿瘤血管的正常化过程。而单纯的肿瘤上清联合AuNPP-FA对HUVEC则无上述效果,提示AuNPP-FA并不是直接作用于血管内皮细胞,而是通过肿瘤细胞充当中间媒介,改变肿瘤细胞细胞因子的分泌,进而促使血管内皮细胞功能的正常化。4.AuNPP-FA刺激肿瘤细胞分泌SEMA3A,抑制血管内皮细胞Smad2/3信号通路利用 Real-time PCR、Western blot 及 ELISA 试剂盒检测经 AuNPP-FA 刺激后,各类促/抑血管生长因子的表达变化,结果发现肿瘤细胞分泌SEMA3A蛋白明显增加。在对血管内皮细胞作用方面,条件培养基和重组的人源性SEMA3A蛋白均能明显抑制HUVEC Smad2/3信号通路。当血管内皮细胞敲除SEMA3A的受体NRP-1后,Smad2/3信号通路的抑制得到恢复。结果证明AuNPP-FA刺激肿瘤细胞分泌SEMA3A,与血管内皮细胞NRP-1结合后,抑制血管内皮细胞Smad2/3信号通路,从而发挥促进肿瘤血管正常化的作用。结论1、成功制备的AuNPP-FA具有良好的稳定性,能够有效地靶向肿瘤细胞并产生杀伤肿瘤的作用;2、AuNPP-FA在体外抑制肿瘤细胞的增殖,对肿瘤细胞迁移无明显影响,但在体内能够同时抑制肿瘤的增殖和转移;3、AuNPP-FA能够促进肿瘤血管形态、功能正常化,是其抑制体内肿瘤转移的主要效应阶段,而非依赖于抑制肿瘤细胞血管外渗或抑制转移灶增殖阶段;4、AuNPP-FA在荷瘤小鼠中的应用安全,未发现AuNPP-FA对小鼠重要脏器产生明显毒副作用;5、AuNPP-FA刺激肿瘤细胞表达和分泌SEMA3A,后者与血管内皮细胞NRP-1结合,抑制血管内皮细胞Smad2/3信号通路,促进肿瘤血管正常化;6、AuNPP-FA诱导肿瘤血管正常化后,促进CTLs的浸润,提高PD-L1抑制剂联合用药的治疗疗效。