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目的: 通过比较携带AFP、CEA、AFP和CEA抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体转染树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)体外对肝癌细胞及正常细胞的杀伤效果,同时观察DC诱导CTL过程中DC和T细胞的形态学变化,检测DC、T细胞表面分子及T细胞IFN-γ的表达率,初步探讨rAAV转染DC诱导的CTL对肝癌细胞的体外杀伤效应及机制,为其临床应用提供依据。 方法: 采集、分离健康人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)用于制备DC及CTL。DC由细胞因子GM-CSF、IL-4、TNF-α及携带肿瘤抗原基因的重组腺相关病毒载体rAAV-AFP、rAAV-CEA、(rAAV-AFP+rAAV-CEA)分别刺激分化成熟,成熟DC与淋巴细胞混合诱导CTL产生。DC诱导CTL过程中DC和T细胞的形态学变化采用显微镜观察并拍照记录,DC表面分子CD80、CD83、CD86和T细胞表面分子CD4、CD8、CD25、CD69及IFN-γ的表达率采用流式细胞仪检测。MTS法检测rAAV-AFP、rAAV-CEA、(rAAV-AFP+rAAV-CEA)转染DC及未经病毒载体转染DC诱导产生的CTL体外对HepG2细胞及正常细胞的杀伤率,同时与加入抗人主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)I型单抗的CTL对HepG2细胞的杀伤率进行比较,探讨CTL杀伤作用的MHC限制性。 结果: 观察DC培养过程,DC体积逐渐增大,树突增多,逐渐分化、成熟,至第6天时,其表面CD80、CD83、CD86的表达率分别为42%、49%、81%;DC及淋巴细胞混合后,可见明显的成团趋势,培养第14天的T细胞表面CD4、CD25、CD8、CD69表达率分别为49%、5%、43%、33%,且可被刺激分泌IFN-γ。rAAV-AFP、rAAV-CEA、(rAAV-AFP+rAAV-CEA)转染DC诱导产生的CTL均能杀伤HepG2细胞,而对不表达相应肿瘤抗原的正常细胞无明显杀伤作用,差异具有统计学意义(P<0.05);rAAV-AFP-DC-CTL与rAAV-CEA-DC-CTL对HepG2细胞的杀伤率分别为43%、34%,两者间无统计学差异(P=0.21);(rAAV-AFP+rAAV-CEA)-DC-CTL对HepG2细胞的杀伤率更高,为53%,与rAAV-CEA-DC-CTL对比具有统计学差异(P=0.02),而与rAAV-AFP-DC-CTL对比无统计学差异(P=0.26)。未经rAAV转染DC诱导产生的CTL对肿瘤细胞也有杀伤作用,但显著小于 rAAV-DC-CTL(P<0.05)。加入抗 MHCⅠ型单抗的rAAV-DC-CTL对HepG2细胞的杀伤率明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论: rAAV转染的DC可成功诱导出肿瘤特异性的CTL,携带相应肿瘤抗原基因的rAAV转染DC诱导产生的CTL对肝癌细胞具有特异性杀伤作用,且两种携带肿瘤抗原基因的rAAV混合转染DC诱导产生的CTL对肝癌细胞的杀伤毒性更高,可能具有更好的临床应用前景。