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褐飞虱(Nilaparvata lugens)是一种单食性昆虫,只为害水稻,种群繁殖速度快,繁殖量大,是我国及许多东南亚、东北亚国家和地区水稻生产上的重要害虫。表观遗传修饰可在不改变基因组DNA的情况下调控生物体多种生命活动。本论文对褐飞虱中2个DNA甲基转移酶及其相关蛋白基因的cDNA全长进行了克隆,开展了2个DNA甲基转移酶基因的基因结构和分子进化分析。通过数据库及基因组搜索,研究了不同物种中DNA甲基转移酶种类的分布情况。本论文的研究对理解褐飞虱DNA甲基化的表观遗传修饰具有重要的意义。对近年来给农业生产造成重大损失的杂食性害虫——甜菜夜蛾的潜在的RNA干扰致死基因进行克隆,对新害虫防治手段的研究具有重要的意义。1.褐飞虱Dnmtl.N6amt2及DMAPl的全长克隆克隆得到褐飞虱2个DNA甲基转移酶基因和1个DNA甲基转移酶相关蛋白基因即DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 1 (Dnmt1),N6-adenine-specific DNA methyltrans-ferase 2(N6amt2)和DNA methyltransferase 1-associated protein(DMAP1)的cDNA全长序列,并对3个基因氨基酸序列的等电点、分子量及蛋白二级结构进行了分析。三条序列的GenBank登录号分别为KF294265,KF294266,KF294267。2.褐飞虱Dnmt1和N6amt2的基因结构和分子进化分析分别从蛋白结构域、序列相似性、基因结构及进化4个方面对褐飞虱的Dnmt1和N6amt2基因进行了分析。对Dnmt1基因的分析表明,褐飞虱与人、小鼠、非洲瓜蟾及斑马鱼具有完全相同的结构域。不同物种Dnmt1中的结构域序列具有很高的相似性,褐飞虱与非洲爪蟾和斑马鱼相似性为75%,与意大利蜜蜂和人相似性为74%,表明结构域具有保守的重要催化活性。不同物种间Dnmt1基因长度相差很大,内含子和外显子的数量及长度也有很大差别。对N6amt2基因的分析表明,不同物种的催化活性结构域中都含有QFW motif和DPPF motif.褐飞虱与意大利蜜蜂、家蚕和豌豆蚜的序列相似性最高,分别为74%、69%和65%。与Dnmtl基因类似,N6amt2基因长度相差也比较大,但其内含子和外显子的数量及长度差别不大。系统进化分析的结果表明,褐飞虱的Dnmtl及N6amt2均与昆虫中的同源基因具有较近的进化距离。分析表明,褐飞虱同哺乳动物及膜翅目昆虫类似,具有完整的Dnmt基因家族,部分昆虫丢失了Dnmt3,双翅目昆虫只有Dnmt2.昆虫中都含有N6amt2基因。3.褐飞虱不同发育阶段及不同翅型种群Dnmtl和N6amt2的表达分析选取普通种群1至5龄若虫、长翅型未产卵雌虫和产卵盛期雌虫、短翅型未产卵雌虫和产卵盛期雌虫及长、短翅型雄虫共11个样本进行了分析。结果表明,Dnmtl和N6amt2的表达量在若虫阶段没有明显差异,但两个基因在成虫阶段表达量差异明显,达显著水平。无论是长翅型还是短翅型成虫,Dnmtl和N6amt2在未产卵雌虫中表达量均明显低于处于产卵盛期的雌虫表达量。两个基因在未产卵和产卵盛期雌虫的表达量均高于雄虫。选取普通种群中不同日龄的长翅型和短翅型雌、雄虫,对成虫Dnmtl和N6amt2的表达情况开展了分析。结果表明,不同翅型和性别的成虫中两个基因的表达量大多呈先上升后下降的趋势,且两个基因在雌虫中的表达量均明显高于雄虫。这些结果显示,DNA甲基化可能参与调控褐飞虱雌虫的生殖发育。利用实验室长期维护的褐飞虱长翅型和短翅型种群进行进一步分析。结果表明,两个翅型种群的若虫Dnmtl和N6amt2表达量从1龄至5龄均呈下降趋势；Dnmtl在短翅型种群中表达量高于长翅型种群,而N6amt2在长、短翅型种群中的表达量无明显差异。4.褐飞虱)nmtl和N6amt2的RNA干扰分析根据褐飞虱Dnmtl和N6amt2的序列设计并合成了dsRNA,利用饲喂法对褐飞虱2龄末若虫进行RNA干扰实验,利用qRT-PCR检测RNA干扰后不同时间点2个基因的表达量变化情况,结果显示干扰后Dnmtl的表达量与对照组相比竟然有所升高,尤其是第1、2、10、15天的表达量升高更为明显,而在第5、7天表达量仅有略微升高；干扰后N6amt2的表达量与对照组相比在第1天明显升高,但从第2天开始表达量开始持续下降,直至第10天下降最明显,约下降了62%。两个基因的干扰组与对照组相比均未出现表型异常的个体。关于Dnmtl和N6amt2基因的功能尚需深入研究。5.甜菜夜蛾RNA干扰致死基因的克隆对筛选出的4个甜菜夜蛾潜在的RNA干扰致死基因(arf1, arf2, tubulinl, tubulin2)进行了cDNA克隆。获得arf2的cDNA全长及irfl、tubulinl和tubulin2的完整CDS序列。4条基因序列已提交至GenBank,登录号分别为JF915770, JQ653045, JQ653042,JQ653043。对4个基因氨基酸序列的等电点、分子量及蛋白二级结构进行了预测。