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兔波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)和巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是引起兔呼吸道传染病的主要致病菌,临床上这两种菌有时呈现混合感染,由于它们在菌落形态、临床症状以及病理变化等方面都存在许多相似的地方,仅靠表面症状容易造成误诊,所以建立一种操作简便、快速灵敏和特异性强的检测方法显得十分必要。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等在2000年开发的一种新颖的核酸扩增技术,通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用,在恒温条件下高效、快速、特异地扩增靶基因,不需要PCR的热循环步骤和繁琐的电泳检测过程,为病原在临床上的快速诊断提供了全新的思路。本研究针对Bb16S rRNA基因和Pm Kmt1基因,使用在线设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物,然后分别对反应温度和时间、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Betaine浓度、Bst DNA Polymerase浓度以及引物浓度进行了优化,建立了LAMP反应体系。本研究利用LAMP技术对8株兔源性细菌分别进行Bb和Pm的特异性试验,结果显示仅有目标菌株为阳性,其余7株细菌均为阴性,表明LAMP检测技术具有良好的特异性。本研究采用Qiagen试剂盒法制备模板进行LAMP反应,该方法检测Bb和Pm的检出限分别为1.65CFU/mL和1.29CFU/mL,而对照PCR检测Bb和Pm的检出限分别为165CFU/mL和129CFU/mL,表明LAMP技术的灵敏度为普通PCR的100倍。本研究用已优化的LAMP检测方法分别对15份Bb阳性样品和10份Pm阳性样品进行稳定性与重复性试验,检测结果均为阳性,表明该方法具有良好的稳定性与重复性。本研究比较了3种基因组DNA提取方法对LAMP检测结果的影响,研究结果表明LAMP方法对制备模板DNA的要求不高,采用煮沸法提取基因组DNA,不仅节约提取时间,而且也大大降低检测成本。本研究分别检测了54份Bb样品和44份Pm样品,同时与实验室已建立的PCR方法做了比较,结果表明：Bb-LAMP方法的阳性检出率为77.78%,特异性为85.71%,敏感性为100%,符合率为96.3%；Pm-LAMP方法的阳性检出率为47.73%,特异性为88.46%,敏感性为100%,符合率为93.18%。LAMP反应耗时短,可在70min内完成,反应终止后加入1μL SYBR GREENⅠ(1000×)核酸染料,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果,使得整个检测过程更加快速与高效；通过酶切鉴定,测得酶切片段与理论预期值相符,验证了方法的正确性。此外,LAMP反应只需一个简单的恒温水浴锅,不需要昂贵的PCR仪,操作简便,易于在基层推广应用。