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焦虑症是目前发病率较高的身心疾病之一,现代医学认为本病的发生与个体生物学特征和社会心理因素有关。西医主要应用药物干预的方法,但现有抗焦虑药物存在易依赖、起效缓慢、药物间相互作用和不良反应等诸多缺陷。利用中医方剂多成分共存、多靶点、多途径调节的特点,寻找中药抗焦虑新药具有可能。但引入现代焦虑动物模型和药物效用评价技术,从实验角度揭示中医防治焦虑症的现代内涵及其作用机制尚属空白。本课题采用目前国际通用的焦虑动物模型和了解到的焦虑病理生理机制,以中医防治焦虑症的经验以及立法组方思路为背景,选取经典方酸枣仁汤,在确认其抗焦虑作用的基础上,筛选最佳有效剂量,同时探察高架+字迷宫模型(EPM)动物可能存在的内分泌、免疫状态,并从神经-内分泌-免疫网络的角度,在整体、细胞、分子水平上探讨酸枣仁汤抗焦虑作用的可能机制。论文分两部分。文献综述部分主要对酸枣仁汤临床与实验研究进行了总结,对神经-内分泌-免疫网络及焦虑症的发病机制进行了综述。实验研究部分主要从酸枣仁汤抗焦虑作用行为学的量效关系评价、焦虑模型动物内分泌、免疫功能状态探察以及酸枣仁汤抗焦虑的神经-内分泌-免疫网络调节机制三个方面进行了探讨。实验研究一 酸枣仁汤抗焦虑作用行为学的量效关系评价方法:将大鼠随机分为模型、DZP、SZRTⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共 6 组,每组 15 只。其中中药Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别按 3.75g/kg/d、7.5g/kg/d、15g/kg/d、30g/kg/d给予 SZRT 灌胃,DZP 组给予 1mg/kg 灌胃,模型组灌服等容积的生理盐水。各组连续给药 10d,于第 10d 做行为测试,观察和比较各项行为学指标。结果:SZRT在 7.5g/kg～15g/kg 剂量范围内,具有一定的抗焦虑效应,与 DZP 的作用方向一致,从对 EPM 大鼠各项指标影响结果看,以 7.5g/kg 剂量效果最优; 30g/kgSZRT可以显著增加 OE+CE,提高大鼠在封闭臂的 rearing 值,显示出一定的镇静作用。结论:中药 SZRT 在 7.5g/kg～15g/kg 剂量范围内确有抗焦虑效用,因其不影响动物运动能力,故认为该效应可能与其镇静催眠作用无关;达到一定剂量后,SZRT抗焦虑效应并不再伴随剂量的增加而增强,而呈现一定的镇静作用。SZRT 这种小剂量(7.5g/kg～15g/kg)抗焦虑、大剂量(30g/kg)镇静的作用特点提示中药复方可能存在不同给药剂量呈现不同临床效用的现象。实验研究二 焦虑模型动物内分泌、免疫功能状态探察方法:用放免法分别观察和测定大鼠 6 组 3 个时间点(EPM 测试后即刻、3h、<WP=6>2 酸枣仁汤抗焦虑作用的神经-内分泌-免疫网络调节机制6h,空白对照组和模型组)的血 IL-2 和 ACTH 水平变化。结果:经过 EPM 探究后大鼠即刻血清 IL-2 水平出现明显升高,随后的 3～6h 显著下降,并呈现低于正常水平的趋势;即刻至 3h 血浆 ACTH 无明显变化,6h 开始 ACTH 升高显著。结论:EPM 焦虑模型大鼠确有免疫、内分泌系统的改变,且其变化有一定的时程差异,EPM 应用于药物抗焦虑效用机制的研究具有一定的可行性。 实验研究三 酸枣仁汤抗焦虑的神经-内分泌-免疫网络调节机制 整体研究:1. 对 EPM 大鼠神经递质和调质、免疫细胞因子、HPAA 的影响 方法:用高效液相、放免、硝酸盐比色、镉还原法分别测定 EPM 大鼠海马、脾、胸腺的单胺神经递质及其代谢产物含量、下丘脑和血浆β-EP、下丘脑 CRF、血浆 ACTH 和血清 NO、IL-1β、IL-6、TNFα、CORT 水平。结果:与模型组相比,DZP、SZRT 组大鼠海马组织 NE 含量均呈不同程度显著降低,DZP 组降低更为明显;DZP 明显降低海马 5-HT 的含量,明显升高 EPM 大鼠脾 5-HT 的含量;SZRT 明显升高胸腺 5-HIAA 含量;DZP、SZRT 均能显著降低 EPM 大鼠血浆β-EP 含量,对下丘脑β-EP 水平无明显影响;DZP、SZRT 均能明显升高 EPM 焦虑模型大鼠血清 NO 水平;SZRT 可以明显升高 EPM 大鼠血清 IL-1β、TNFα水平,但对 IL-6 含量无明显影响;DZP 并不能改变此焦虑模型大鼠的血清细胞因子水平;DZP、SZRT 能明显升高 EPM 大鼠血浆 ACTH 水平,但对于下丘脑 CRF、血清 CORT DZP、SZRT 作用不明显。结论:降低海马中 NE 的释放,降低 5-HT 功能、抑制海马中 5-HT 的合成,降低血浆β-EP 含量,提高血清 NO 浓度可能是 SZRT 抗焦虑作用的重要环节,SZRT 还可通过提高 EPM 大鼠血清 IL-1β、TNFα水平,增加垂体 ACTH 的合成或分泌,调节焦虑状态下机体内分泌-免疫功能紊乱。 2.对 EPM 大鼠脑组织 GABAA受体 mRNA 表达的影响 方法:行为学结束后取 EPM 大鼠全脑,提取总 RNA,RT-PCR 扩增。结果:各组 GABA-A receptor 基因经 RT-PCR 扩增后,均获得了设计大小的 DNA 片段 392bp,RT-PCR 扩增产物半定量分析结果显示,SZRT 组 GABAA受体 mRNA 表达水平参数明显高于模型和 DZP 组。结论:SZRT 能明显提高 EPM 焦虑大鼠脑组织 GABAA受体 mRNA表达水平,推测 SZRT 可能通过增加脑组织 GABAA受体量来提高 GABAA能的功能,发挥其抗焦虑作用;而 DZP 不能提高 EPM 焦虑大鼠脑组织 GABAA受体 mRNA 的表达水平,表明其对脑组织 GABAA受体的量无明显作用,推测 SZRT