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由于肺炎链球菌对人类危害大且耐药菌株不断增多，肺炎链球菌疫苗的预防作用越来越重要。肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)和溶血素（Ply）已被确定为肺炎链球菌疫苗的候选因子，但它们免疫保护作用的侧重点不同。PspA的免疫保护作用主要是抗S.pn的定殖，Ply是S.pn细胞内毒素，其免疫保护性必须在S.pn自溶后才能发生。天然的Ply在小鼠体内具有免疫保护作用，但是它具有细胞毒性,作为人类疫苗是不合适的。对Ply的细胞毒作用和补体激活必需的基因片段ΔA146R147进行突变，制成具有免疫原性但对红细胞和有核细胞没有毒性作用的“肺炎链球菌溶血素”，用其免疫小鼠后发现能使细胞毒性降低99.5%以上，可作为载体蛋白广泛的应用于融合疫苗的研制。本研究拟将二者的优点结合起来，通过串联重组表达技术将PspA与Ply进行融合，构建了含有两种基因的融合表达质粒并进行了原核表达与鉴定，以便同时研究两种候选因子在S.pn蛋白疫苗研制中的作用。 后续实验中，将通过动物实验和体外细胞粘附抑制试验对重组融合蛋白的生物学活性进行鉴定，观察融合蛋白对动物的免疫保护作用及对肺炎链球菌粘附宿主细胞的抑制作用，从而探讨该融合蛋白在研制肺炎链球菌多基因亚单位疫苗中的潜在价值。 目的： 利用基因定点突变技术扩增Ply突变基因△Ply，基因重组技术构建△Ply与PspA基因的串联融合表达蛋白PspA-△Ply 方法： 1.根据肺炎链球菌TIGR4型表面蛋白A和溶血素基因序列设计引物，定点突变法扩增Ply突变基因, PCR法扩增PspA基因。 2.运用基因重组技术构建pET32a-PspA-△Ply表达载体，双酶切与测序验证重组质粒。 3.重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经不同时间、不同温度，不同浓度IPTG诱导表达融合蛋白，Western Blot鉴定表达产物 结果： 1.采用重叠PCR的方法成功扩增出Ply突变体基因片段ΔPly，将其与载体连接后得到重组质粒pET32a-ΔPly，经双酶切和测序分析证实重组质粒克隆成功。 2.用T普通PCR的方法扩增出与预期大小一致的PspA目的基因片段。目的基因与载体pET32a-ΔPly连接后的重组质粒PET32a-PspA-ΔPly，经双酶切鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功。 3. SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小以及表达量的多少。Western blot验证融合蛋白的表达。 结论： 成功实现Ply基因的定点突变，构建PspA-△Ply融合蛋白串联表达载体，并对该蛋白进行鉴定和分析，为研究新型抗S.pn蛋白疫苗奠定基础。