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【目的】原发性胆囊癌是胆道系统中常见的恶性肿瘤,具有恶性程度高,早期易转移等特点。其早期的淋巴转移是影响患者预后的重要因素。研究发现,VEGF-C和VEGF-D与肿瘤的淋巴管生成及淋巴结转移密切相关,因此二者又被称作淋巴管生成因子。我们课题组前期研究发现,TNF-α可以在体外及动物体内促进胆囊癌微淋巴管形成,且有部分依赖于胆囊癌细胞分泌的VEGF-C,但是否也能通过上调VEGF-D的分泌,进而促进淋巴管的生成还不明确。因此本研究拟在体外条件下探讨TNF-α是否通过上调胆囊癌细胞株VEGF-D的表达来促进胆囊癌微淋巴管生成。以期为胆囊癌淋巴结转移的研究提供实验室依据,为新药的研究提供作用靶点。【方法】体外培养胆囊癌细胞,用不同梯度浓度的外源性TNF-α分别刺激三株胆囊癌细胞(NOZ、GBC-SD及SGC-996)12h及24h,用荧光定量PCR(Real-time PCR)及酶联免疫吸附试验(ELSIA)法分别从转录和翻译水平检测TNF-α对三株胆囊癌细胞株(NOZ、GBC-SD及SGC-996)的VEGF-D表达的影响;采用带有VEGF-Dsi RNA的慢病毒感染NOZ细胞,荧光显微镜下观察转染效率,用RT-PCR及Western-blot分别从m RNA及蛋白水平检测其对VEGF-D表达的干扰效果。建立胆囊癌NOZ细胞和人真皮淋巴管内皮细胞HDLEC3D共培养体系,观察TNF-α对淋巴内皮细胞体外成管的影响,计算淋巴管成管数量来分析其能否通过上调VEGF-D分泌促进胆囊癌细胞微淋巴管生成。【结果】Real-time PCR及ELISA结果显示,当TNF-α的刺激浓度在10-50ng/ml范围时,可呈浓度依赖地促进NOZ和GBC-SD细胞的VEGF-Dm RNA及蛋白的表达,尤以刺激24小时明显,其各加药组的VEGF-D m RNA及蛋白的表达量均高于对照组(均p<0.05),且各处理组组间VEGF-D的表达量有明显差异(均p<0.05)。当TNF-α刺激浓度为50ng/ml时,VEGF-D表达量最高,而当刺激浓度上升到100ng/ml时,其表达量又有所下降。但研究也发现,TNF-α对胆囊癌SGC-996细胞的VEGF-D m RNA及蛋白表达无影响(p>0.05)。用带有VEGF-Dsi RNA的慢病毒感染NOZ细胞72h后,荧光显微镜下观察转染效率可达90%,用RT-PCR及Western-blot检测发现,干扰组的VEGF-D的表达明显受到抑制(P<0.05)。NOZ细胞和HDLEC细胞3D共培养结果显示,VEGF-D干扰组(NOZ/sh VEGF-D组)淋巴小管生成的数量明显低于空白对照组(NOZ组)及阴性对照组(NOZ/sh CTRL组),有统计学差异(P<0.05)。且TNF-α刺激后,空白对照组、阴性对照组和干扰组的淋巴管生成的数量均有不同程度的升高,但干扰组升高的幅度明显低于空白对照组及阴性对照组,有统计学差异(P<0.05)。【结论】1、低剂量TNF-α能够从核酸及蛋白质水平上促进NOZ、GBC-SD胆囊癌细胞株VEGF-D表达,并呈时间及浓度依赖性;而对胆囊癌细胞株SCG-996无促进VEGF-D表达作用。2、TNF-α通过上调胆囊癌细胞VEGF-D的表达进而促进胆囊癌微淋巴管生成。