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目的:百草枯是一种非选择性、廉价、高效、对环境无害的除草剂。这些特性使其在世界许多国家得到了广泛的应用。但百草枯对于人体有剧毒,致死量特别低,且无特效解毒剂。由于意外接触、误服或有意轻生者摄入百草枯后,百草枯优先在肺部积聚,在3天内可导致肺组织炎症浸润、肺水肿、肺泡结构破坏,引起急性肺损伤,严重者可能发展为急性呼吸窘迫综合征,危及生命。因此进一步研究百草枯的中毒致病机制及治疗方法尤为重要。目前所知造成急性肺损伤的主要原因是氧化应激反应使炎症细胞激活,释放大量炎症因子,产生级联放大效应,最终导致炎症失控,促炎/抗炎的细胞炎症因子失衡。因此,在百草枯中毒所致的急性肺损伤治疗过程中,早期控制炎症反应,减少促炎因子释放,增加抗炎因子水平,调节促炎/抗炎的细胞因子失衡是主要治疗方法。巨噬细胞广泛存在于体内,在调节机体免疫、炎症反应、维持体内稳态和抵抗病原体入侵方面有着重要的作用。存在于不同组织中的M0型巨噬细胞,根据所处器官的微环境的变化可分化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1巨噬细胞具有促炎反应能力,可产生促炎的细胞因子;而M2巨噬细胞具有抗炎能力和修复受损组织的能力。在百草枯中毒后肺组织发生严重的炎症反应,如果能够通过通路的调控,使M1型巨噬细胞极化水平降低,M2型巨噬细胞极化水平升高,则能够纠正细胞炎症因子失衡,减轻急性肺损伤,这为百草枯中毒的救治提供新的治疗思路。但巨噬细胞M1/M2型极化在百草枯中毒引起急性肺损伤的过程中发挥的作用目前尚无报道,且相关机制并不明确。本实验首先应用百草枯对小鼠肺泡巨噬细胞进行处理,研究百草枯刺激下,M1/M2型巨噬细胞的极化程度,以明确巨噬细胞在百草枯中毒急性肺损伤中对炎症指标的影响。随后应用雷帕霉素阻断m TOR通路后再进行百草枯染毒处理,从细胞及大体两个层面观察m TORC1/p70S6K通路对肺泡巨噬细胞M1型极化的影响,以及炎症因子和急性肺损伤程度的变化。最后分别应用PPAR-γ激活剂GW1929及右美托咪定预处理,随后进行百草枯染毒刺激,从细胞及大体两个层面观察PPAR-γ/STAT3通路对肺泡巨噬细胞M2型极化的影响,以及炎症因子和急性肺损伤程度的变化。以巨噬细胞功能分化为核心,分析其可能的内在生物学机制,以探索治疗百草枯中毒急性肺损伤的新方法。研究方法:1.百草枯急性中毒对肺泡巨噬细胞M1/M2极化影响的研究。第一部分实验在MH-S小鼠肺泡巨噬细胞的培养基内加入百草枯染毒,建立百草枯中毒的细胞模型,在24小时、36小时、48小时三个时间点分别观察0μM、1μM、5μM、10μM、25μM五个不同浓度的百草枯刺激下,巨噬细胞M1型极化的程度及IL-6和TNF-α分泌水平。并在炎症指标最高的时间点观察M1/M2巨噬细胞的极化比例。2.m TORC1/p70S6K通路对于百草枯中毒所致急性肺损伤中肺泡巨噬细胞M1极化影响的研究。第二部分的研究分为MH-S小鼠肺泡巨噬细胞实验和C57BL/6小鼠大体实验两个方面:细胞实验中,在百草枯染毒前加入m TOR抑制剂雷帕霉素进行预处理,染毒24h后观察m TORC1/p70S6K通路抑制后巨噬细胞M1/M2极化的变化,以及释放细胞炎症因子水平的变化。大体实验中,先建立百草枯中毒模型,在6h、12h、24h、48h、72h五个时间点观察小鼠急性肺损伤程度,及m TORC1/p70S6K通路表达情况。然后在小鼠腹腔注射百草枯前,预先腹腔注射雷帕霉素,中毒24h后,观察小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞M1/M2极化情况,以及肺泡灌洗液中炎症因子水平及肺损伤程度的相应变化。3.PPAR-γ/STAT3通路对于百草枯中毒所致急性肺损伤中肺泡巨噬细胞M2极化的影响及右美托咪定的潜在治疗价值的研究。第三部分的研究也分为MH-S小鼠肺泡巨噬细胞实验和C57BL/6小鼠大体实验两个方面:细胞实验中,在百草枯染毒前分别加入PPAR-γ激动剂GW1929以及右美托咪定进行预处理,染毒24h后观察PPAR-γ/STAT3通路表达情况,巨噬细胞M1/M2极化的变化,以及释放细胞炎症因子水平的变化。大体实验中,在小鼠腹腔注射百草枯前,分别预先腹腔注射GW1929及右美托咪定,中毒24h后,观察观察PPAR-γ/STAT3通路表达情况,小鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞M1/M2极化情况,以及肺泡灌洗液中炎症因子水平及肺损伤程度的相应变化。随后应用PPAR-γ的抑制剂GW9662干预右美托咪定的作用,观察PPAR-γ抑制后是否能够逆转右美托咪定对巨噬细胞极化及肺损伤的影响。结果:1.百草枯急性中毒时小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化水平明显升高在MH-S小鼠肺泡巨噬细胞染毒后,同一百草枯浓度下,在24小时、36小时、48小时三个时间点观察,M1型巨噬细胞的极化程度逐渐增加,IL-6和TNF-α分泌水平也同步升高。在同一时间点内,百草枯浓度0μM、1μM、5μM、10μM、25μM随着浓度的增加M1极化程度逐渐增加,IL-6和TNF-α分泌水平也同步高。并且百草枯25μM作用24h后M1巨噬细胞的极化比例明显高于M2型极化。说明百草枯中毒确实可以导致巨噬细胞M1型极化增多,进而引起炎症因子大幅升高造成急性炎症风暴,从免疫细胞功能分化这一新的角度明确了百草枯中毒后急性肺损伤的发生机制。2.抑制m TORC1/p70S6K可降低百草枯中毒所致小鼠急性肺损伤中肺泡巨噬细胞M1极化水平细胞实验中,在百草枯染毒前加入m TOR抑制剂雷帕霉素进行预处理,染毒24h后巨噬细胞M1极化水平明显降低,细胞培养液中IL-6和TNF-α浓度也明显降低。大体实验中,在腹腔注射30mg/kg的百草枯后,6h、12h、24h、48h、72h五个时间点观察小鼠急性肺损伤程度,24h时小鼠肺损伤程度最重,且m TORC1/p70S6K通路在24h时激活程度最强。在小鼠腹腔注射百草枯前,预先腹腔注射雷帕霉素,中毒24h后,小鼠肺泡巨噬细胞M1极化程度降低,肺泡灌洗液中炎症因子水平降低,肺损伤程度也同步减轻。这一部分明确了雷帕霉素抑制m TOR受体后可抑制M1型巨噬细胞的极化,降低中毒后肺损伤程度,具有治疗意义,并且对于m TORC1/p70S6K通路及上下游蛋白具有类似作用的其它药物也可能存在潜在的治疗意义。3.激活PPAR-γ可抑制STAT3的活化,能够降低百草枯中毒后小鼠泡巨噬细胞M1极化程度并增加M2的极化程度。右美托咪定也可以激活PPAR-γ,具有治疗百草枯的潜在临床价值。细胞实验中,在百草枯染毒前分别加入PPAR-γ激动剂GW1929以及右美托咪定进行预处理,染毒24h后观察PPAR-γ得到激活,同时STAT3活性受到抑制,使得小鼠肺泡巨噬细胞M1极化减少,M2极化增加,同时培养液中细胞炎症因子水平降低。大体实验中,在小鼠腹腔注射百草枯前,分别预先腹腔注射GW1929及右美托咪定,中毒24 h后,小鼠肺组织PPAR-γ得到激活,同时STAT3活性受到抑制,肺泡灌洗液中巨噬细胞M1减少,M2极化增加,肺泡灌洗液中炎症因子水平明显降低,并且肺损伤程度也相应减低。随后应用PPAR-γ的抑制剂GW9662干预右美托咪定的作用,PPAR-γ抑制后,STAT3随之激活,右美托咪定降低小鼠肺泡巨噬细胞M1极化,增加M2极化的抗炎作用被逆转,小鼠急性肺损伤加重。右美托咪定可以激活PPAR-γ,并具有抑制M1激活M2的双重抗炎作用,尤其是对于M1极化的抑制作用在之前是少有报道的。这种抗炎作用对于百草枯急性肺损伤具有非常好的治疗价值。结论:1.小鼠肺泡巨噬细胞在百草枯中毒后M1型极化明显增多,其程度与肺部炎症加重程度呈正相关,证明肺泡巨噬细胞在百草枯中毒时参与了致病过程,且关系密切。2.通过抑制m TORC1/p70S6K通路,可降低染毒后小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化水平,减少促炎因子分泌,减轻急性肺损伤程度。证明雷帕霉素治疗百草枯中毒肺损伤的潜在价值。3.通过激活PPAR-γ,可抑制STAT3的活化,从而降低染毒后小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化水平,增加M2型极化水平,调节炎症因子失衡,减轻急性肺损伤程度。4.右美托咪定可以激活PPAR-γ,起到降低染毒后小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化水平,增加M2型极化水平,起到“双重”抗炎效果,调节炎症因子失衡,减轻急性肺损伤程度,具有治疗百草枯的潜在临床价值,并为百草枯的治疗提供了新的思路及理论依据。