论文部分内容阅读
NADH氧化酶（NADH Oxidase，EC1.6.99.3，简写为NOX）是一种氧化还原酶类，直接将NADH氧化为NAD+。国外研究发现，很多微生物细胞中存在NADH氧化酶，它在辅酶再生和调控微生物代谢方面有重要作用。随着氧化还原酶的工业化应用日益发展，相应的辅酶再生问题成为研究热点。NOX由于反应物氧不需要另行加入，并且产物结构简单，对主要产物分离纯化无影响的优点，在氧化型辅酶NAD~＋再生中表现出了巨大的应用潜力。本课题从泡菜中分离的乳酸菌中筛选出一株产NADH氧化酶酶活较高的乳杆菌（Lactobacillus sp. LP-01），并从中调出编码NADH氧化酶的目的基因nox（Genbank：HQ441199），对其进行了TA克隆和初步的生物信息学分析，同时对该段目的基因的克隆表达做了初步研究。首先，实验从泡菜中分离筛选了9株乳酸菌，并通过测NADH氧化酶酶活，得到一株酶活相对较高的乳酸菌株。16S rDNA测序鉴定结果表明其为乳杆菌，命名为Lactobacillus sp. LP-01。其次，对该菌NADH氧化酶基因进行了克隆。提出菌的基因组DNA后，应用通过基因比对所设计的简并引物，PCR扩增出目的片段。扩增出的nox基因（Genbank：HQ441199）TA克隆于pMD18-T载体并转入大肠杆菌E. coli DH5_α中。测序表明目的基因nox，全长为1353bp，有完整的启动子和终止子，共编码450个氨基酸，产物分子量为486,000。氨基酸序列分析发现：基因编码产物含4个半胱氨酸，推测其参与了酶分子中二硫键的形成和肽链的折叠。肽链的N端为FAD-binding1（GCTHAGT），并有FAD-binding2结合区（TSDPDIYGAGDS），显示此酶与报道相符，催化中需要辅基FAD的参与。序列中还有一个NAD结合区（VIVIGGGYIGTELV），用以结合底物NADH。最后，对目的基因nox的表达进行了初步研究，实验以带有SalI和XhoI酶切位点的引物将基因克隆于表达载体pET-32a(+)，并转化进入宿主菌BL21（DE3）pLysS中。随后进行了重组菌的发酵与酶蛋白的诱导，发酵产物以SDS-PAGE电泳验证，发现nox基因产物以胞内可溶蛋白和包涵体两种形态存在，进一步，对胞内可溶蛋白的初步酶活测定表明，这部分产物的NOX酶活为6.57U/g菌体。