研究背景根据世界卫生组织国际癌症研究所最近更新的统计数据报告,乳腺癌患者在全球新发数量为226万,约占新发恶性肿瘤的11.7%,已超肺癌并成为发病率第一位的恶性肿瘤。在我国,乳腺癌同样位居女性恶性肿瘤发病率的首位,每年约有140万人确诊为乳腺癌,死亡人数高达50万人。在发展中国家,乳腺癌死亡率普遍较高,且早期检出率低,约70%的乳腺癌患者检出时已进展至局部晚期。新辅助化疗（Neoadjuvant Chemotherapy,NAC）被广泛应用于局部晚期乳腺癌的治疗,尤其针对三阴性和Her-2阳性以及伴有侵袭性因素的激素受体阳性的乳腺癌患者。新辅助化疗对于乳腺癌的局部处理具备以下优势:可使原发肿瘤体积退缩,减少手术中组织的切除量,使一部分不具备保留乳房条件的局部晚期乳腺癌患者实现保乳的意愿;可使腋淋巴结降期,使部分初始需实施腋窝清扫的患者避免了腋窝淋巴结清扫。新辅助化疗前或手术治疗前预测新辅助化疗后退缩模式,筛选合适患者实施保乳是治疗的难点。新辅助化疗后,残留肿瘤边界往往更加难以确定,导致手术切除精准度降低;其次,新辅助化疗后还常出现局部治疗不足等状况。有研究报道,乳腺癌新辅助化疗后保留乳房可能引起较高的局部复发率。新辅助化疗后残余肿瘤可分为向心性退缩和非向心性退缩两种模式。呈现向心性退缩是实施保乳手术的理想状态,可以在保证切缘安全性前提下减少健康组织的切除量,获得更好的美学效果;新辅助化疗后呈现非向心性退缩模式,即使得到术中病理“切缘未见肿瘤细胞”的结果,其周围仍可能残存卫星灶,导致较高的局部复发风险。在2017年St.Gallen共识中同样建议,根据乳腺癌新辅助化疗后退缩模式,建议采用不同的手术策略。接受核磁共振（Magnatic Resonance Imaging,MRI）扫描是目前评估新辅助化疗后乳腺癌残余范围的有效措施。然而,关于MRI评估乳腺癌新辅助化疗后退缩模式准确度的报道较少;同时,MRI仅在新辅助化疗结束后完成评估,目前缺乏治疗前预测退缩模式的生物学标记物。自2012年人类的癌症基因组图谱计划实施以来,我们对同种肿瘤间的异质性有了更进一步认识,肿瘤异质性致使同种肿瘤患者对治疗的反应存在明显差异,已成为肿瘤研究与治疗面临的重要难题之一。同种肿瘤不同个体间或同一肿瘤的不同区域间在分子水平存在显著差异。随着“组学技术”的不断发展,基于高通量的测序技术开始应用于肿瘤学的研究中,使我们对乳腺癌的异质性有了更深的认识,提高了分子水平对肿瘤的认知,用以指导临床诊断与治疗,称之为“精准治疗”。本课题在前期课题组成员的研究基础上,应用病理连续大切片技术和MRI技术构建乳腺癌新辅助化疗后退缩模式,探讨形成乳腺癌新辅助化疗后不同退缩模式临床病理及分子水平的相关因素。具体实验研究包括以下三个方面:①在前期研究基础上扩充乳腺癌的样本量,分别对新辅助化疗后的乳腺癌患者分别进行核磁共振重建与病理三维重建,以病理三维重建为金标准,评估MRI判断乳腺癌新辅助化疗后退缩模式的准确度,并探索可能的影响因素。②在分子水平阐述乳腺癌新辅助化疗后退缩模式与基因异质性的相关性,展示呈现不同退缩模式的乳腺癌在新辅助化疗前后的基因构成差异;不同受体状态的乳腺癌新辅助化疗后基因异质性的变化特点,精准的基因检测预测新辅助化疗后的退缩模式。③纳入近两年完成新辅助化疗并接受手术切除的乳腺癌患者,利用456基因大Panel对新辅助化疗前后的石蜡切片标本进行高通量基因组测序,阐述乳腺癌经新辅助化疗前后出现的基因异质性改变:基因突变类型、突变分数的改变、肿瘤内部基因异质性（MATH）的改变,不同受体状态乳腺癌在新辅助化疗前基线水平的差异。第一部分受体状态对乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式准确度的影响目的MRI被广泛应用于乳腺癌新辅助化疗后疗效的评估,但有关新辅助化疗后退缩模式准确度的研究十分有限。本研究以病理连续大切片为金标准评价乳腺癌新辅助化疗后退缩模式的准确度及其影响因素。方法在前期研究的基础上,纳入2014年8月至2018年11月收治的105例局部中晚期乳腺癌患者,增加样本量。患者在新辅助化疗前后完善乳腺MRI检查,接受蒽环序贯紫杉类为基础方案的新辅助化学治疗,行根治手术后切除的乳腺癌样本进行病理连续大切片,利用3D-DOCTOR软件分别构建乳腺癌新辅助化疗后的三维病理及MRI退缩模式,收集患者的临床资料,包括激素受体状态、人表皮生长因子受体2受体状态、肿瘤分期等。以病理为金标准,计算MRI组和病理组符合率,应用Kappa检验分析MRI组诊断的一致性,评估影响乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式的准确度及其影响因素。结果1.乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式的敏感性、特异度、阳性预测值、阴性预测值、总体准确性分别为92.8%、97.2%、98.5%、87.5%、94.3%。2.分子分型（p=0.022）、雌激素受体ER（p=0.009）、孕激素受体PR（p=0.027）、残余肿瘤的病理分期（p=0.044）与MRI评估新辅助化疗后退缩模式的准确度相关,Her-2状态与乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式的准确度无相关性（p=0.176）。3.乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式的阳性预测值为98.5%,阴性预测值为87.5%,化疗后的肿瘤直径与MRI评估乳腺癌新辅助后退缩模式的准确度相关（p=0.044）。结论1.乳腺MRI病理连续大切片与评估新辅助化疗后退缩模式有较高的一致性为94.3%。2.激素受体ER、PR状态是影响乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式准确度的因素,乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式准确度与Her-2受体状态未见相关性。分子分型影响乳腺MRI评估新辅助化疗后退缩模式准确度,特别是三阴性乳腺癌患者。3.乳腺MRI评价乳腺癌NAC后退缩模式时,对于呈现非向心性退缩模式或pCR患者易造成高估;残留肿瘤直径与乳腺MRI评估NAC退缩模式的准确性相关。第二部分肿瘤基因异质性MATH与乳腺癌新辅助化疗后退缩模式的相关性研究目的阐述乳腺癌新辅助化疗后的不同退缩模式在基因水平的差异,探讨肿瘤基因异质性（MATH）与新辅助化疗后退缩模式的相关性,为新辅助化疗后退缩模式提供预测标记物。方法纳入乳腺外科一病区24名接受新辅助化疗的乳腺癌患者,术后建立病理三维退缩模式,利用高通量测序技术分别检测新辅助治疗前和治疗后FFPE样本,测定456个乳腺癌相关基因的突变状况,利用等位基因突变分数计算肿瘤基因异质性,同时新辅助化疗后手术切除样本进行病理三维重建新辅助化疗后退缩模式。阐述不同退缩模式的乳腺癌在新辅助化疗前、后不同的基因突变变化,MATH与不同退缩模式的相关性;基于不同受体状态的乳腺癌新辅助化疗前、后肿瘤基因异质性的变化。结果1.呈现向心性退缩模式（Concentric Shrinkage Mode,CSM）的乳腺癌样本经新辅助化疗后突变的数量减少,无新发突变出现;呈现非向心性退缩模式（Non-concentric Shrinkage Mode,NCSM）的乳腺癌样本经新辅助化疗后突变的数量明显增加,并有新发突变发生,在CSM队列中携带TP53突变比例从NAC前的70%下降到NAC后的30%,在NSCM中的其从50%提高到100%。2.向心性退缩模式的乳腺癌样本MATH值在新辅助化疗前、后与非向心性乳腺癌样本均有明显差别（p=0.026,p=0.003）。对比两种不同退缩模式在新辅助化疗前、后总体MATH值,CSM组总体MATH值与NCSM组的MATH值存在明显差异（39.66 vs 102.7,p＜0.0001）。3.新辅助化疗前MATH和新辅助化疗后MATH对不同退缩模式的判别情况,两变量的方差分析显示,p值分别为0.026和0.003,说明两变量在判别退缩模式中均有统计学意义（p=0.026,p=0.003）;在所纳入的样本中,NAC前样本或/和NAC后样本MATH值达到48.5至59.7之间的某一个阈值,肿瘤在NAC后将呈现向心性退缩模式。4.75%（3/4）Luminal A型乳腺癌患者MATH值经新辅助化疗后升高,66.7%（2/3）的Luminal B型患者（不包括Luminal Her-2阳性型）在NAC后MATH值下降,Her-2阳性型中,（7/8）患者在NAC前MATH值低于阈值。结论1.不同退缩模式的乳腺癌新辅助前、后具有不同的突变特点,其中,TP53突变在向心性退缩模式乳腺癌患者新辅助化疗后突变减少,在非向心性退缩模式的乳腺癌患者突变增加。2.两种不同退缩模式在新辅助化疗前、后MATH值存在明显差别;新辅助化疗前、后的MATH值与乳腺癌新辅助化疗后退缩模式呈非线性关系。3.新辅助化疗前、后的MATH值与新辅助化疗后退缩模式术后病理退缩模式相关。4.基于不同受体状态乳腺癌基因异质性经新辅助化疗后的变化特点,个体化的分子检测预测乳腺癌新辅助化疗后退缩模式:针对Luminal A型和Her-2阳型乳腺癌患者,NAC前标本为宜;Luminal B型乳腺癌患者以NAC后样本为宜。第三部分基于高通量测序技术分析乳腺癌新辅助化疗前后基因异质性差异目的基于高通量测序技术阐述乳腺癌肿瘤基因异质性以及其在乳腺癌新辅助化疗前后的变化。方法研究纳入24名接受新辅助化疗的乳腺癌患者,利用高通量测序技术分别检测新辅助治疗前和治疗后FFPE样本,测定456个乳腺癌相关基因的突变状况。分别测定突变种类、突变分数以及乳腺癌基因异质性在新辅助化疗前、后的变化;不同受体状态乳腺癌的基因异质性水平差异。结果1.在这组乳腺癌患者中,新辅助化疗前后最常见的突变基因为TP53和PIK3CA,在NAC前样本中共检测到113个突变基因,70个基因突变仅在NAC前出现;同时,29个基因突变仅在NAC后样本中出现,这些基因突变伴随新辅助化疗而出现;43个基因在NAC前和NAC后样本中同时检测到突变。2.不同受体状态乳腺癌患者新辅助化疗前样本MATH值基线水平存在差异（p=0.027）:Luminal A型与Her-2阳性型乳腺癌患者、Luminal B型乳腺癌患者的MATH值之间存在显著差异（p=0.004,p=0.022）,三阴性乳腺癌与其它类型（Luminal A型、Luminal B型、Her-2阳性型）之间的基因异质性MATH 值差异无统计学意义（p=0.125,p=0.578,p=0.578）。3.分别配对比较乳腺癌新辅助化疗前穿刺样本与新辅助化疗后手术样本MATH值,结果显示:新辅助化学治疗后乳腺癌的MATH值发生改变。进行配对t检验后,经过新辅助化疗后,总体的肿瘤的基因异质性（MATH值）未见明显降低（p=0.384）。4.新辅助化疗前、后MATH,总体MATH值与肿瘤突变位点数目均无相关性（p=0.089）,MATH值与肿瘤突变负荷（TMB）未见相关性（p=0.091）。结论1.乳腺癌新辅助化疗前、后基因突变类型、基因突变分数发生明显改变。2.不同受体状态乳腺癌肿瘤的基因异质性（MATH值）在新辅助化疗前基线水平存在差异。3.乳腺癌患者基因异质性（MATH值）经新辅助化疗后明显改变,经新辅助化疗后,总体的MATH值未见明显降低。4.乳腺癌新辅助化疗前、后肿瘤基因异质性MATH与基因突变数目、TMB未见相关性。