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第一部分miR-143抑制MDS细胞株SKM-1小鼠移植瘤的生长并诱导细胞凋亡目的:检测miR-143在MDS/AML患者骨髓标本以及人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株SKM-1和MUTZ-1细胞中的表达情况,探讨miR-143对SKM-1细胞增殖、凋亡的影响,以及进一步在NOD/SCID小鼠体内复杂微环境状态下,探索miR-143对SKM-1细胞移植瘤生长及凋亡的影响。方法:收集MDS/AML患者骨髓标本30例(MDS 18例,sAML 12例;MDS低危组8例,MDS高危组10例;MDS 5q-综合征2例),健康人对照骨髓标本10例。将新鲜的骨髓标本提取出单个核细胞,同SKM-1细胞、MUTZ-1细胞分别用试剂盒提取总RNA,利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测其中miR-143的相对表达量。将重组慢病毒载体 LV-hsa-miR-143、LV-hsa-miR-143-inhibitors 及其阴性对照空载体LV-control稳定转染至SKM-1细胞中,利用倒置荧光显微镜以及流式细胞术分别检测细胞转染效率,qRT-PCR检测转染后各组SKM-1细胞中miRNA-143的表达水平,利用CCK-8法检测细胞内miR-143的表达水平的改变对SKM-1细胞增殖的影响,流式细胞术检测miR-143表达水平改变后SKM-1细胞的周期以及凋亡率变化,Western blot技术检测miR-143是否通过Fas/FasL通路来促进SKM-1细胞的凋亡。将过表达miR-143组、空病毒组和空白对照组细胞悬液(2×107个/200μl)分别注射至各组NOD/SCID小鼠皮下,成瘤后三周利用活体荧光成像仪观测各组移植瘤的荧光表达水平,后颈椎脱臼法将各组小鼠处死,将移植瘤分离取出并测量其重量(g)以及体积(mm3)。后取每个瘤体相对完整的一部分放入4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋切片后分别进行H&E染色以及免疫组化观察。最后,我们利用western blot法检测了小鼠瘤体组织cleaved-caspase-3,-8,-9、FasL和AKT的蛋白表达。结果:与健康对照相比,MDS/AML病人骨髓样本和SKM-1细胞、MUTZ-1细胞的miR-143相对表达水平均明显较低;高风险MDS组(RAEB-2)比低风险MDS组(RAEB-1)miR-143的相对表达水平低;具有5号染色体缺失(del(5q-))的患者骨髓样本中miR-143的表达水平明显低于无染色体缺失的患者。过表达miR-143组细胞的增殖率明显低于空病毒组和空白组,而低表达miR-143组的增殖率显著高于两个对照组。过表达miR-143组的细胞凋亡率比两个对照组均显著增加约1倍左右,而低表达miR-143组的细胞凋亡率约降低为两个对照组的四分之一左右。此外,通过对各组细胞周期的检测发现,与两个对照组相比,过表达miR-143组处在G1期的细胞数量增加超过20%,而低表达miR-143组的细胞数目减少了约20%。活体荧光成像仪观测结果表明,过表达miR-143组小鼠的移植瘤荧光强度明显低于空病毒组和空白对照组。过表达miR-143组的移植瘤的重量和体积明显要比空病毒组和空白对照组的瘤体小。与空病毒组和空白对照组相比,过表达miR-143组的染色质聚集、呈分块状以及核固缩现象明显增加,凋亡小体数量增多,提示过表达miR-143会促进小鼠移植瘤组织细胞的凋亡。免疫组化结果表明,过表达miR-143组的FasL染色呈强阳性而AKT染色呈阴性,提示miR-143很可能在小鼠瘤体组织内是通过Fas/FasL进而促进其凋亡。Western blot法检测移植瘤组织内蛋白表达发现,与空病毒组和空白对照组相比,过表达miR-143组的凋亡相关因子cleaved-caspase-3,-8、-9和FasL的表达在蛋白水平上均显著增加,而低表达miR-143组结果则正好相反。对FasL拮抗通路蛋白AKT的检测发现其蛋白表达在miR-143过表达时降低,而在miR-143低表达时增高。结论:miR-143在MDS/AML病人骨髓标本以及SKM-1细胞、MUTZ-1细胞中表达水平低于健康对照,在小鼠瘤体组织中,miR-143可通过Fas/FasL通路促进细胞凋亡从而抑制移植瘤的的生长。第二部分miR-143增强MDS细胞株SKM-1细胞对阿糖胞苷的药物敏感性目的:探究miR-143在阿糖胞苷对人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞化疗敏感性中所起的作用以及相应的作用机制。方法:将重组慢病毒载体LV-hsa-miR-143、LV-control稳定转染至SKM-1 细胞中,将实验分为 3 组:LV-hsa-miR-143 组、LV-control 组、SKM-1组。采用CCK-8法检测miR-143转染前后,SKM-1细胞对不同浓度化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)生长抑制率的变化。利用流式细胞仪检测三组细胞的周期以及凋亡率的变化,使用Western blot技术探索miR-143增强阿糖胞苷对SKM-1细胞化疗敏感性的作用机制。结果:过表达miR-143的SKM-1细胞在Ara-C浓度为2.5 μM、5 μM、10 μM、25μM的剂量下,生长抑制率百分率相比于LV-control组和SKM-1组均有统计学差异(P<0.05)。过表达miR-143组的SKM-1细胞在Ara-C浓度为5 μM时的细胞凋亡率比两个对照组增加均超过20%。另外,通过对各组细胞周期的检测发现,与两个对照组相比,过表达miR-143组的SKM-1细胞在Ara-C浓度为5 μM时,处在G1期的细胞数量增加超过15%。Western blot法检测凋亡相关因子Akt和pAkt的蛋白表达结果显示,LV-hsa-miR-143+Ara-C(5μM)组pAkt蛋白相对表达量明显要低于LV-control+Ara-C(5μM)组和 SKM-l+Ara-C(5μM 组。结论:过表达miR-143能够提高SKM-1细胞对化疗药物阿糖胞苷的药物敏感性,表现为通过降低Akt磷酸化从而使得凋亡率增加,细胞周期G1期阻滞增多。