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研究背景前列腺癌是目前最为常见的一种男性泌尿系统肿瘤,它多发生于50岁以上的男性。前列腺癌在西方欧美等国家是男性最常见的恶性肿瘤,其发病率位于西欧国家男性恶性肿瘤的第二位,已成为男性恶性肿瘤患者的第一大死因。近些几年来,由于我国男性居民饮食习惯、生活方式的改变,该病的发病率呈逐年上升趋势。流行病学研究人员调查发现,前列腺癌的发病受多种因素的影响,如:体内雄激素含量增多、肥胖、年龄增加、吸烟、大量饮酒以及家族遗传史等环境因素和遗传因素。然而人们对前列腺癌具体的发病机制仍不十分清楚,故许多国内外的专家学者对前列腺癌的细胞学开展了广泛的研究。前列腺癌细胞存在着雄激素依赖和非依赖两种状态,去雄激素治疗可以很好地控制雄激素依赖型前列腺癌细胞的生长,可通过雄激素受体信号转导途径诱导细胞的凋亡。一旦细胞转变成激素非依赖型,抗雄激素治疗失去效果,疾病则迅速发展。事实上,前列腺癌患者在确诊时,有一半以上已经是发展为局部进展性或转移性前列腺癌,失去了根治性手术治疗的机会,只能采用保守的阻断雄激素为主的内分泌综合治疗,临床上大多数患者经过雌激素或去势手术后,也会逐渐由雄激素依赖型前列腺癌转变为雄激素非依赖型前列腺癌,转变后的前列腺癌对化疗的敏感性也就随之降低,治疗效果往往不理想。目前,化疗是激素非依赖前列腺癌的主要治疗手段,且通常采用以最大耐受量为基础的大剂量化疗方案,由于毒副作用明显,限制了其在临床中的广泛使用。与大剂量化疗药物破坏细胞的DNA合成不同,低剂量的化疗药物可以影响细胞某些特定基因和蛋白表达,增加肿瘤细胞对凋亡的敏感性,也可避免发生明显的细胞毒性,具有很广阔的应用前景。上述情况表明,针对如何延缓雄激素依赖型前列腺癌向雄激素非依赖型前列腺癌的转变,以及探求雄激素非依赖型前列腺癌的治疗方法,已经成为目前研究前列腺癌方面的焦点课题。在研究前列腺癌发病机制的同时,人们普遍发现前列腺癌中晚期患者血清中瘦素的表达水平逐渐升高,经证实,瘦素在前列腺癌的发生、发展中起到了至关重要的作用。有学者用瘦素在体外刺激雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞后,观察到血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1 ( transforming growth factor-β1, TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor, bFGF)过量表达,而前列腺癌PC-3细胞的迁移活性也相应增加,结果表明瘦素在促进雄激素非依赖型前列腺癌细胞增殖及诱导细胞迁移的方面,发挥了一定的作用。蒽环类抗肿瘤药的经典代表药为阿霉素(ADM),抗瘤谱广,疗效好。但由于其骨髓抑制等不良反应,限制了其广泛而长期的使用,因此肿瘤药物工作者积极的在寻求疗效好而毒副作用小的新型蒽环类抗肿瘤药。吡喃阿霉素又名吡柔吡星(T H P),为半合成蒽环类抗肿瘤化合物,是ADM4-O-吡喃基取代衍生物。有研究发现,化疗药物阿霉素在低毒性剂量下可以增加肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)对激素依赖前列腺癌LNCaP细胞的凋亡诱导作用,其作用机制与细胞内凋亡相关蛋白c-FLIP受到抑制有关。肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是近年发现的肿瘤坏死因子家族新成员,能够诱导多数肿瘤细胞凋亡,而对大多数正常细胞无影响,其诱导肿瘤细胞凋亡是通过它的受体介导完成的。目前已发现5种受体:死亡受体DR4和DR5(存在胞内死亡结构域)诱导肿瘤细胞凋亡,可溶性受体(OPG)及DCR1(无胞内死亡结构域)和DCR2(胞内死亡结构域不完整)均不能传递TRAIL的死亡信号。在生理情况下TRAIL主要通过与DR5结合发挥细胞凋亡诱导作用。相关研究提示DR5介导的信号传导通路在TRAIL诱导的细胞凋亡中占更重要的地位。目的本实验旨在研究抑制前列腺癌细胞中瘦素表达与吡喃阿霉素对人前列腺癌DU-145细胞株周期的抑制作用的相关性,明确瘦素低表达影响吡喃阿霉素对前列腺癌的治疗效果。进而为前列腺癌的临床治疗提供新的治疗策略,提高临床疗效,改善患者预后,延长患者生存期。方法1.采用体外细胞培养法,购自中科院上海细胞库的激素非依赖型前列腺癌DU-145细胞株作为实验用细胞。2.传代培养,取对数生长期DU-145细胞株种植96孔板,瘦素(100ng/ml)干预24h后随机分组,分为阴性对照组,瘦素干预组及药物干预组,添加不同浓度的瘦素拮抗剂,用MTT法分别测定上述各组细胞的细胞活性(OD值),计算细胞生长抑制率。3.取对数生长期DU-145细胞株加瘦素100ng/ml干预24h后,随机分组,共分为6组,即对照组、人重组瘦素拮抗剂组、吡喃阿霉素0.5mg/L组、吡喃阿霉素1.0mg/L组、人重组瘦素拮抗剂+吡喃阿霉素0.5mg/L组、人重组瘦素拮抗剂+吡喃阿霉素1.0mg/L组。用MTT法分别测定上述6组体外培养前列腺癌DU-145细胞24h、48h的细胞增殖活性。4.用流式细胞仪分别检测上述6组前列腺癌DU-145细胞24h、48h的细胞增殖周期的抑制情况。5.采用Western blotting法检测上述6组前列腺癌DU-145细胞中DR5的表达情况。6.用SPSS13.0软件对结果进行统计学分析。结果1. MTT法测定显示:在100ng/ml瘦素干预下的各组细胞的增殖活性明显优于空白对照组,重组人瘦素拮抗剂组50ng/ml时DU-145细胞株生长水平明显受抑制,细胞生长抑制率为:15.86%±0.82%,继续加大剂量并无明显抑制DU-145细胞生长的作用。2. MTT法测定显示:(1)单用吡喃阿霉素干预组DU-145细胞株均被明显抑制,随药物剂量增大细胞生长抑制率逐渐提高,各组差异有显著性(P<0.05);(2) 24h及48h细胞抑制率有显著差异(P<0.05);(3)联合用药组较单独用药组,随药物剂量增大及时间延长细胞生长抑制率逐渐提高,各组差异有显著性(P<0.05)。3.流式细胞仪测定结果显示:(1)单用瘦素拮抗剂组差异有显著性(P<0.05),即DU-145细胞较对照组G1细胞比率增高,G2期细胞比率明显下降。(2)单用吡喃阿霉素组较对照组有显著差异(P<0.05),即DU-145细胞S期明显增多。(3)联合用药组较对照组及单独用药组均有显著差异(P<0.05),即较吡喃阿霉素组DU-145细胞,G1、S期细胞比率增高;较瘦素拮抗剂组DU-145细胞,S期细胞比率明显增高。4. Western blotting结果显示:联合用药组较单独用药组DR5的表达随着吡喃阿霉素剂量的增加及时间的延长呈上升的趋势,各组间有明显差异(P<0.05)。结论吡喃阿霉素合并瘦素抑制剂可以抑制激素非依赖型前列腺癌DU-145细胞增殖活性,增加相关细胞凋亡蛋白的表达,并且随着吡喃阿霉素浓度增加无论是前列腺癌细胞增殖的抑制作用还是相关蛋白的表达均呈上升趋势。