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青蒿素(artemisinin)是从草本植物黄花蒿(Artemisia annua L.)中分离提取的一种新型倍半萜内酯化合物,是治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐青蒿素联合疗法(Artemisinin Combination Therapies,ACTs)为治疗疟疾的首选方法。然而,青蒿素只在黄花蒿中发现,在野生的黄花蒿中,青蒿素的含量很低,只占干重的0.01%~0.6%,远不能满足市场的需求。化学合成青蒿素,产率低、成本高、毒性大且线路复杂,很难实现工业化生产。因此,利用遗传工程技术,提高黄花蒿中青蒿素及其他倍半萜的含量,已经是植物次生代谢研究领域的热点之一。茉莉酸(Jasmonic acid)及其衍生物统称为茉莉酸类物质(Jas),是重要的植物信号分子,能够调节植物的生长发育,对环境变化做出相应的防御响应,同时对次生代谢产物的积累还有一定的调节作用,已有研究报道外源喷洒JA能够提高青蒿素的含量。青蒿素生物合成代谢途径中,ALDH1(Aldehyde dehydrogenase1)基因催化青蒿醛和二氢青蒿醛,使其转变成青蒿酸和二氢青蒿酸,青蒿酸和二氢青蒿酸能够在光下自发的转化为青蒿素B和青蒿素。已有研究报道,通过半定量分析ALDH1基因在根中几乎没有表达,在腺毛体中的表达量最高。青蒿素合成代谢途径中的几个关键基因ADS、CYP71AV1、DBR2基因序列及其启动子已经被克隆,功能也已经被研究,醛脱氢酶ALDH1基因在青蒿素代谢途径中的功能已有报道,但关于ALDH1基因启动子的相关研究还未见报道,所以本研究通过对ALDH1基因启动子的研究,更深入的探究激素和生物胁迫能够提高青蒿素含量的作用机制。本实验根据NCBI所报道的ALDH1基因序列(登录号:FJ809784),从黄花蒿的基因组数据库设计ALDH1基因启动子特异性引物,通过FPNI-PCR技术,克隆得到ALDH1基因的启动子序列,并对其进行生物信息学分析,通过PCR技术所得到的ALDH1基因启动子全长2100bp,其中含有MeJA调控响应元件TGACGmotif,GA3响应元件GARE-motifs和P-boxes,胁迫响应元件TC-rich。构建pCAMBIA1391Z:ALDH1:GUS功能验证载体,ALDH1启动子启动GUS报告基因,并利用蘸花法,对拟南芥进行稳定转化,收取成熟的拟南芥种子,在有Hygr抗性的筛选培养基的平板上对其种子进行筛选,并通过PCR检测获得转基因阳性拟南芥。对转基因拟南芥进行GUS染色,结果显示ALDH1启动子在幼苗的叶子顶端及其嫩叶中均被染成蓝色,且在叶中只有腺毛体被染成蓝色,这与ALDH1基因在腺毛体中表达量最高相吻合;将转基因拟南芥分别用MeJA和伤害处理,GUS基因的表达量都得到了提高。超量表达黄花蒿中的转录因子能够促进青蒿素的积累,通过双荧光素酶活性分析,超量表达转录因子AaERF2和Aa ORA,LUC/REN的比值显著的高于对照组,而超量表达Aa WRKY1,LUC/REN的比值与对照组相比没有明显差异,结果表明转录因子AaERF2和Aa ORA能够激活ALDH1启动子的表达,AaWRKY1不能激活ALDH1启动子的表达,这与启动子中不含有W-box相吻合。综上所述,通过本实验研究,ALDH1基因在青蒿素合成代谢过程中的作用得到更深入的了解,为进一步筛选青蒿素生物合成相关转录因子奠定了基础。