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活性氧（reactive oxygen species,ROS）是细胞正常代谢过程的产物。如产生过多可对核酸、蛋白质和脂类等生物大分子造成氧化损伤,从而影响细胞的功能甚至存活。对于快速增殖的癌细胞,高速的增殖和活跃的代谢导致其细胞内ROS水平高于正常细胞。虽然生化和信号通路的改变及抗氧化系统的加强使癌细胞能耐受其高ROS含量,但临床实践及实验研究都证明癌细胞大都处于对进一步氧化打击高度敏感的状态。因此进一步升高癌细胞的ROS或削弱其抗氧化的能力被认为是有效的抗癌方式。研究表明,土木香内酯（Alantolactone,ATL）具有在癌细胞内迅速而显著地进一步升高ROS、导致DNA氧化损伤进而触发癌细胞凋亡的活性,但其单药使用时所需药物浓度较高,因此寻找联合用药方案对于ATL的开发具有积极意义。ATR是DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）的关键蛋白激酶之一,主要由DNA复制压力或修复DNA双链断裂时引起的单链DNA（ssDNA）激活。激活的ATR通过Chk1激活细胞周期检验点,导致细胞周期减速以缓解复制压力、同时促进修复;如DNA损伤过于严重或不能修复,则触发细胞凋亡,使问题细胞得以清除。但在癌细胞中,由于p53、RB等突变失活或抗凋亡通路的阻滞等原因,ATR通常不能启动凋亡而主要起保护作用。因此,抑制ATR被证明是治疗癌症的有效手段。但是,单独抑制ATR通常不足以将癌细胞杀死,因此已进入临床试验的ATR抑制剂都与常规化疗药如拓扑异构酶抑制剂等联合使用。鉴于化疗药物的毒副作用及抗药性等问题,有必要进一步筛选能与ATR抑制剂起更好协同作用的更理想的药物。为此,我们探讨了ATL与ATR抑制剂VE821在SW480结肠癌细胞中的协同作用效果及相关机理。首先,MTT实验确定ATL在SW480结肠癌细胞中作用48小时的半数有效剂量（IC50）为15.20?M,因此我们选择远低于IC50细胞毒性较低的10?M ATL进行实验。MTT和流式细胞术检测发现10?M ATL处理SW480细胞12至48小时后,细胞的存活和凋亡细胞的比例均没有明显变化,即没有明显的细胞毒性;但S期和G2/M期细胞比例有所上升,提示一定程度的S和G2/M期周期阻滞。免疫荧光染色发现10?M ATL处理3小时后,SW480细胞内ROS含量显著升高;6小时后,γH2A.X阳性细胞数和Chk1的磷酸化（Chk1-pT14）明显上升,证明存在DNA损伤和ATR激活。以上结果表明亚致死剂量的ATL（10?M）虽然对细胞存活没有明显影响,但其诱发的ROS导致了明显的DNA损伤,继而激活ATR和S和G2/M期细胞周期检验点。另一方面,由于ATR抑制剂单独使用时对癌细胞没有明显细胞毒性,我们根据文献报道选用25?M、12.5?M、6.25?M和3.125?M的VE821来检测其对SW480结肠癌细胞的影响。结果表明VE821单独使用时未引起明显的细胞凋亡或ROS水平和γH2A.X信号的变化,但Chk1-pT14信号明显减弱,显示ATR被抑制但对进行正常DNA复制和增殖的癌细胞影响不大。接下来,当以上几种浓度的VE821与10?M ATL一起使用时,SW480细胞的存活均受到显著抑制,CompuSyn软件计算得出的联合指数（CI）表明这两种药物间存在协同抗癌作用。由于12.5?M VE821与10?M ATL联合的CI值最低,因此这对组合被用于后续实验。MTT结果表明,12.5?M VE821与10?M ATL联合对SW620结肠癌、HT1080纤维肉瘤、HepG2肝癌、SiHa宫颈鳞癌、A549肺腺癌细胞均有显著的抑制作用,而BEAS2B人正常肺上皮细胞所受抑制不明显,证明ATL+VE821可能具有广谱抗癌活性,且对癌细胞的毒性远高于正常细胞。免疫荧光染色和Western blot检测发现联合用药组的γH2A.X阳性细胞数和RPA-pS4/8含量显著高于单独用药组,显示ATR被抑制后,S期检验点不能被DNA损伤激活,因此ATL诱发的DNA氧化损伤的修复不能正常进行且与继续进行的DNA复制产生冲突,从而形成显著升高的γH2A.X和RPA-pS4/8信号。碱性彗星实验（Comet assay）发现联合用药组的细胞中DNA断裂的数量（单链和双链断裂之和）显著高于两个单药组,证明在没有ATR的保护下,DNA损伤与DNA复制的冲突导致了复制叉坍塌和大量DNA断裂。流式细胞术检测证实S期阻滞消失,而G2/M期阻滞加重且出现细胞凋亡,提示DNA断裂通过ATM-Chk2-p53通路激活G2/M期检验点和诱导细胞凋亡。用NAC阻断ROS升高后,ATL+VE821的联合作用效果消失,证明ATL引起的ROS升高是ATL+VE821的协同作用的基础。综上所述,低剂量的ATL作用于癌细胞后,虽不至于导致细胞死亡,但能升高细胞中ROS水平并产生一定的DNA损伤;与VE821联合后,ATR和S期检验点被抑制,DNA氧化损伤转化为DNA链断裂,进而通过ATM-Chk2-p53通路触发G2/M期阻滞和细胞凋亡。以上研究结果表明ATL与ATR抑制剂联合对癌细胞有良好的合成致死效果（synergistic anticancer effect）,为ATL的开发和ATR抑制剂协同作用药物的筛选提供了较重要参考信息。