论文部分内容阅读
目的： 通过探究三种髓系白血病细胞株中miR-128a和Bmi-1基因的表达差异，观察miR-128a靶向调控Bmi-1对髓系白血病细胞增殖和凋亡的作用，并初步阐明其作用机制，为治疗白血病提供新的策略。 方法： 1、常规培养（人慢性髓细胞白血病细胞株K562、人急性单核白血病细胞株THP-1及人急性髓细胞白血病细胞株KG1）三种髓系白血病细胞株至对数期生长后收集细胞。采用实时荧光基因定量qRT-PCR方法检测正常人外周血单个核细胞以及对数期三种细胞株中Bmi-1基因的表达情况。2、采用生物信息学基因软件预测Bmi-1的靶基因，然后通过qRT-PCR检测三种白血病细胞株(K562、KG1和THP-1)和正常人外周血单个核细胞中miR-128a的相对表达量。3、采用生物信息技术预测软件预测miR-128a的靶基因，同时应用双荧光素酶实验确证白血病细胞株中miR-128a与靶分子Bmi-1之间的调控关系。4、特异性上调miR-128a后qRT-PCR检测三种细胞株中的表达量，同时采用免疫印迹法western blot检测上调后Bmi-1的表达变化情况。5、MTT实验，软琼脂克隆形成实验，免疫荧光及western blot检测瞬时转染miR-128amimic后对三种髓系白血病细胞株增殖活性及单个细胞克隆形成能力的影响。6、过表达髓系白血病细胞中miR-128a后，采用流式细胞仪和western blot检测三种细胞株凋亡比率及相关蛋白的相对表达量。 结果： 1、qRT-PCR实验结果显示，与健康人外周血单个核细胞表达量相比，Bmi-1基因在K562、THP-1和KG1三种白血病细胞中呈明显高表达。 2、microRNA生物学软件（Targetscan Human7.1、miRanda和microRNA org）预测Bmi-1的上游靶基因之一可能是miR-128a。miR-128a表达量在三种髓系白血病细胞株中显著低于健康人外周血单个核细胞的表达量，且miR-128a与Bmi-1的表达量呈负相关。 3、分别用生物信息预测软件（Targetscan Human7.1、miRanda和microRNA.org）和双荧光素酶实验验证显示，Bmi-1是miR-128a的靶基因。 4、与瞬时转染miR-128a NC序列的对照组比较，转染siRNA质粒序列miR-128a mimic至K562、THP-1和KG1三种髓系白血病细胞株后，Bmi-1基因的表达都受到抑制，同时MTT结果显示细胞增殖能力明显下降。 5、软琼脂克隆形成实验显示，特异性上调三种白血病细胞株中的miR-128a表达量后与对照组相比，三种白血病细胞株单个细胞克隆形成能力都显著下降。 6、过表达三种白血病细胞株中的miR-128a后，流式细胞术和western blot两项结果分别显示，三种细胞株的凋亡比率明显高于对照组。 结论： (1)Bmi-1和miR-128a在选取的三种髓系白血病细胞株中的表达具有显著差异且呈负相关。 (2)miR-128a通过靶向负调控Bmi-1来调控白血病细胞的增殖和凋亡能力。